雙水相體系精制牡丹花色苷及其穩(wěn)定化方法的研究
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作者：鄭曉蒙
牡丹（Paeonia suffruticosa Andr）又名花王、洛陽王、富貴花，屬芍藥科、芍藥屬植物，其花瓣中含有豐富的花色苷類成分，經(jīng)鑒定為[1-2]：矢車菊-3-0-葡萄糖苷、矢車菊-3，5-0-二葡萄糖苷、天竺葵-3-0-萄萄糖苷、天竺葵-3, 5-0-=葡萄糖苷、芍藥-3-0-葡萄糖苷和芍藥-3，5-0-二葡萄糖苷。陳姍姍等[3]對花色苷在乙醇／硫酸銨雙水相體系中的分配行為進(jìn)行了研究，結(jié)果表明花色苷主要集中在上層有機(jī)相中，分配系數(shù)與其結(jié)構(gòu)有關(guān)。小分子親水醇／鹽雙水相萃取相對于傳統(tǒng)高聚物雙水相萃取具有分相快、效果好、有機(jī)相易回收、成本低等優(yōu)點，此外雙水相萃取法條件溫和，有利于分離過程中花色苷的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。
花色苷屬天然植物色素，其在溶解狀態(tài)下穩(wěn)定性較差，易受溫度、pH、金屬離子等因素的影響[4]。樊金玲等[5]研究發(fā)現(xiàn)，牡丹花色苷在高溫條件下會發(fā)生褐變，褐變指數(shù)隨加熱時間和pH的增加而增大。通過分子輔色作用可以提高花色苷的穩(wěn)定性．Awika
等[6]研究發(fā)現(xiàn)阿魏酸和單寧酸可提高花青素的穩(wěn)定性；Sun等[7]曾報道阿魏酸對紅樹莓花色苷有較好的輔色效果，最佳輔色條件為pH 4，花色苷與輔色劑質(zhì)量比1：100;李穎暢等[8]研究發(fā)現(xiàn)，Zn2+、Mn2+不僅對花色苷有增色效應(yīng)，而且可以提高其穩(wěn)定性。目前主要是采用單一的穩(wěn)定劑（或輔色劑）對花色苷進(jìn)行穩(wěn)定化處理，多種穩(wěn)定劑復(fù)配使用的研究相對較少。
利用花色苷與糖類等雜質(zhì)在有機(jī)相和水中溶解度的差異，采用雙水相體系對牡丹花色苷進(jìn)行萃取精制，并考察有機(jī)酸、金屬離子、pH對花色苷穩(wěn)定性的影響，篩選較好的穩(wěn)定劑，通過單因素試驗和響應(yīng)面分析優(yōu)化牡丹花色苷穩(wěn)定化的方法，旨在為開發(fā)牡丹花色苷復(fù)合穩(wěn)定劑提供理論依據(jù)，為拓寬牡丹花色苷的應(yīng)用范圍，促進(jìn)其開發(fā)利用提供參考價值。
1 材料與方法
1.1材料與試劑
牡丹干花，粉碎至40~60目；乙醇、鹽酸、石油醚、氯化鈉、磷酸氫二鈉、硫酸銨、碳酸鈉、硫酸錳、氯化鈣、氯化鋁、丙二酸、咖啡酸等，均為國產(chǎn)分析純。
1.2儀器與設(shè)備
XFB-400小型植物粉碎機(jī)：吉首市中誠制藥機(jī)械廠；UV-1800紫外可見分光光度計：島津國際貿(mào)易有限公司；RE100Pro旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海人和科學(xué)儀器有限公司；SHB-III水循環(huán)真空泵：北京博遠(yuǎn)祥德科學(xué)儀器有限公司；GT10-2高速臺式離心機(jī)：北京時代北利離心機(jī)有限公司。
1.3牡丹花色苷的提取與精制
1.3.1牡丹花色苷粗提物的制備
稱取一定量的牡丹花瓣干粉，以70%乙醇溶液作為提取劑，以料液比1：40( g/mL)加入溶劑，在4℃條件避光提取12 h，殘渣反復(fù)提取2～4次至提取液無色，合并提取液，減壓濃縮后得牡丹花色苷粗提物。
1.3.2雙水相法精制牡丹花色苷
在圓底燒瓶中加入一定比例的無水乙醇和蒸餾水以及一定量的分相鹽，構(gòu)成雙水相體系，添加1g牡丹花色苷粗提物，磁力攪拌30 min后靜置分層，花色苷富集在上層有機(jī)相，多糖等雜質(zhì)主要集中在下層水相中，測定上下相中花色苷和多糖的濃度，計算富集因子和萃取率。
1.3.3花色苷含量的測定
參照Sun等[9]的方法，采用pH示差法對花色苷的含量進(jìn)行測定。
1.3.4多糖含量的測定
參照Zou等[10]的方法，采用苯酚一硫酸法對總多糖的含量進(jìn)行測定，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程為y=13.105x-0.001 7，R2=0.999 1。
1.4牡丹花色苷穩(wěn)定化方法的研究
1.4.1有機(jī)酸對牡丹花色菅穩(wěn)定性的影響
配制200μg/mL的牡丹花色苷溶液，分別添加不同的有機(jī)酸（丙二酸、咖啡酸、月桂酸和抗壞血酸），使有機(jī)酸在體系中的濃度為0.05 mol/L，避光條件下穩(wěn)定30 min，然后放置在80℃的水浴鍋中保溫，每隔2h取樣測定520 nm處的吸光度，并計算8h后花色苷的保存率（花色苷的濃度與其吸光度成正比，因此保存率=加熱處理后溶液的吸光度/加熱處理前溶液的吸光度）。
1.4.2金屬離子對牡丹花色苷穩(wěn)定性的影響
配制200 μg/mL的牡丹花色苷溶液，分別加入一定濃度的金屬鹽（硫酸錳、氯化鈣、硫酸亞鐵、氯化鋁）溶液，使有金屬離子在體系中的濃度為5 mmol/L，避光條件下穩(wěn)定30 min，然后放置在80℃的水浴鍋中保溫，每隔2h取樣測定520 nm處的吸光度，并計算8h后花色苷的保存率。
1.4.3單因素試驗設(shè)計
根據(jù)以上試驗結(jié)果，選擇丙二酸和Mn2+作為穩(wěn)定劑，考察兩者濃度和溶液pH對花色苷保存率的影響。
1.4.4 Box-Benhnken Design試驗設(shè)計
選擇丙二酸濃度、Mn2+濃度和pH三個因素，以花色苷在800C放置8h后的保存率為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面分析試驗，確定牡丹花色苷穩(wěn)定化的最佳條件。
2結(jié)果與討論
2.1雙水相體系萃取精制牡丹花色苷工藝條件的確定
2.1.1雙水相體系中分相鹽的選擇
在圓底燒瓶中添加30 mL蒸餾水和20 mL無水乙醇，分別選擇磷酸氫二鈉、碳酸鈉、硫酸銨作為分相鹽，分相鹽的添加量均接近飽和狀態(tài)，構(gòu)成雙水相體系，對花色苷粗提物進(jìn)行萃取精制。試驗結(jié)果如圖1所示，碳酸鈉與乙醇形成的雙水相體系不穩(wěn)定，萃取過程中易析出晶體；磷酸氫二鈉和硫酸銨均能與乙醇形成穩(wěn)定的雙水相體系，但磷酸氫二鈉／乙醇雙水相體系呈弱堿性，不利于花色苷結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，萃取率較低；硫酸銨／乙醇體系中花色苷的萃取效果最好，因此選擇硫酸銨作為分相鹽。
2.1.2雙水相體系中乙醇和分相鹽添加量的確定
在體系中加入不同體積比的無水乙醇與蒸餾水，
以及不同質(zhì)量的硫酸銨，考察乙醇和分相鹽添加量對花色苷和多糖萃取率及富集因子的影響。通過預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)，乙醇比例較低時，雙水相體系分相困難，且上下相之比較小，不利于花色苷的萃取，而乙醇比例過高時，雙水相體系不穩(wěn)定，萃取過程中下相極易析出晶體，這是因為雙水相的形成過程實際上是乙醇分子與鹽離子爭奪水分子的過程，乙醇體積分?jǐn)?shù)過低時，需要一定量的鹽與其爭奪水分子才能形成分相，而乙醇體積分?jǐn)?shù)較高時，由于乙醇水化能比較大，水分子過多集中在上層有機(jī)相，導(dǎo)致下相析出晶體。因此，選擇乙醇與水的體積比在2：3—3：2的范圍內(nèi)進(jìn)行后續(xù)試驗。
試驗結(jié)果如圖2所示，控制乙醇添加量，隨著硫酸銨添加量的增加，花色苷在上相中的萃取率和富集因子均先增加后降低，多糖在下相的萃取率逐漸增加，富集因子變化較小。這是由于隨著分相鹽添加量的增加，雙水相體系的分相能力逐漸增強(qiáng)，上下相物理化學(xué)性質(zhì)的差別趨于顯著，有利于花色苷與多糖等雜質(zhì)的分離；但分相鹽添加量過大時，下相易析出晶體，雙水相體系不穩(wěn)定，影響花色苷的萃取。
在不同的乙醇比例條件下，通過調(diào)整分相鹽的添加量，均可使花色苷得到較高的萃取率。乙醇與水的體積比為2:3時，花色苷萃取效果最佳時所需的硫酸銨添加量較大，不利于下相的后續(xù)處理。乙醇與水的體積比為3:2時，多糖在下相中的富集效果不佳。綜合考慮花色苷與多糖的分離效果以及分相鹽的使用成本，選擇乙醇與水的體積比為1:1，硫酸銨添加量為5.5 g，構(gòu)成雙水相體系，花色苷在上相中的萃取率可達(dá)96.43%。
2.2牡丹花色苷穩(wěn)定化方法的研究
2.2.1有機(jī)酸對牡丹花色苷穩(wěn)定性的影響
試驗結(jié)果如表1所示，丙二酸和咖啡酸對花色苷有增色效果，添加后吸光度顯著增加，月桂酸對花色苷的增色效果不顯著，抗壞血酸對花色苷有減色作用；隨著加熱時間的延長，空白組和有機(jī)酸添加組的吸光度均有所下降，丙二酸可以增強(qiáng)花色苷的穩(wěn)定性，加熱8h后的保存率是空白對照組近2倍，咖啡酸和月桂酸對花色苷的穩(wěn)定性無顯著影響，加熱8h后的保存率與空白對照組接近，抗壞血酸對花色苷的穩(wěn)定性有破壞作用，加熱8h后保存率幾乎為0。
2.2.2金屬離子對牡丹花色苷穩(wěn)定性的影響
試驗結(jié)果如表2所示，四種金屬離子都可增加花色苷的吸光度，增色程度由大到小分別為Al3+、M n2+、C a2+、Cu2+；隨著加熱時間的延長，空白組和金屬離子添加組的吸光度均有所下降，Mn2+可以增強(qiáng)花色苷的穩(wěn)定性，加熱8h后的保存率遠(yuǎn)大于對照組，其它金屬離子對花色苷的穩(wěn)定性影響較小，保存率由大到小分別為Mn2+、Ca2+、Al3+、Cu2+、對照組。
2.2.3丙二酸濃度對牡丹花色苷穩(wěn)定性的影響
考察不同濃度丙二酸對牡丹花色苷穩(wěn)定性的影響，試驗結(jié)果如圖3所示，花色苷的保存率隨著丙二酸濃度的增大而增加，濃度大于0.08 mol/L時保存率趨于穩(wěn)定，因此選擇丙二酸濃度為0.08 mol/L。
2.2.4 Mn2+濃度對牡丹花色苷穩(wěn)定性的影響
固定丙二酸濃度為0.08 mol/L，考察不同濃度Mn2+對牡丹花色苷穩(wěn)定性的影響，試驗結(jié)果如圖4所示，花色苷的保存率隨Mn2+濃度的增大先增加后減少，這是由于金屬離子可通過與B環(huán)含鄰位羥基的花色苷絡(luò)合提高其穩(wěn)定性，但金屬離子濃度過高時，產(chǎn)生的金屬一單寧配合物對花色苷有減色效應(yīng)[11]。Mn2+濃度為6 mmol/L時，花色苷的保存率最高，穩(wěn)定性最好。
2.2.5溶液pH對牡丹花色苷穩(wěn)定性的影響
固定丙二酸濃度為0.08 moI/L，Mn2+濃度為6 mmol/L，考察溶液pH對牡丹花色苷穩(wěn)定性的影響，試驗結(jié)果如圖5所示，低pH條件下(pH 2，3)花色苷的穩(wěn)定性較好，保存率在75%以上，隨著pH增加，花色苷的保存率逐漸下降，這是由于花色苷在強(qiáng)酸性條件下以黃烊鹽陽離子狀態(tài)存在，呈穩(wěn)定的紅色，隨著pH增加，花色苷會形成無色的甲醇假堿[12]。
2.2.6響應(yīng)面試驗結(jié)果分析
2.2.6.1試驗方案與回歸方程
根據(jù)單因素試驗結(jié)果，通過三因素三水平響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化試驗條件，試驗因素水平見表3，試驗設(shè)計與結(jié)果見表4。將表4的數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.6軟件分析，以丙二酸濃度(A)、Mn2+濃度(B)、pH(C)為自變量，以花色苷保存率y為因變量建立二次響應(yīng)面回歸方程，方程為：Y=-100.041 25+2.795 31A+6.352 50B+29.148 75C-0.004 875AB-0.096 375AC+0.115 00BC-0.014 328A2_0.503 44B2_4.201 25C2。
方差分析見表5，由表可知，模型p<0.000 1，說明響應(yīng)面回歸模型擬合程度極顯著，失擬項p>0.05不顯著，調(diào)整確定系數(shù)為0.988 9，說明回歸方程的擬合程度較好，該模型可以用來預(yù)測和分析花色苷的保存率。該模型中A、C、A2、C2均小于0.000 1達(dá)到極顯著水平，B、AC、B2顯著，AB、BC不顯著，A、B、C三個因素對保存率的影響由大到小為：丙二酸濃度、pH和Mn2+濃度。除去不顯著項，方程可修正為：Y=-100.041 25+2.795 31A+6.352 50B+29.148 75C-0.096 3 75AC - 0.014 328A2_0.503 44B2_4.201 25C2。
2.2.6.2響應(yīng)面分析
通過比較響應(yīng)曲面和等高線圖（圖6）可知，試驗條件范圍內(nèi)存在響應(yīng)面最高點，響應(yīng)曲面的坡度和等高線的形狀可以反映因素對響應(yīng)值的影響程度以及兩因素之間的交互作用，如圖6(b)所示，響應(yīng)面曲面坡度陡峭，等高線呈橢圓形且比較密集，說明丙二酸濃度和pH對花色苷保存率的影響較大，且兩者的交互作用較為顯著；此外，結(jié)合表5和圖6可知，M n2+濃度對花色苷保存率的影響相對較小，且與丙二酸濃度和pH的交互作用都不顯著。
2.2.6.3最優(yōu)方案的確定與驗證
利用Design-Expert 8.0.6軟件得到花色苷保存率最大的條件為：丙二酸濃度87.94 mmol/L; Mn2+濃度6.17mmol/L; pH 2.55�；ㄉ毡４媛实念A(yù)測值為79.57%。驗證試驗根據(jù)所得最優(yōu)條件進(jìn)行微調(diào)：丙二酸濃度88mmol/L; Mn2+濃度6.2 mmol/L; pH 2.6。在此條件下進(jìn)行試驗，花色苷保存率為79.21%與預(yù)測值接近，說明該模型優(yōu)化所得參數(shù)準(zhǔn)確可靠。
3結(jié)論
利用花色苷與雜質(zhì)在有機(jī)相和水中溶解度的差異，采用乙醇／鹽雙水相體系對牡丹花色苷粗提物進(jìn)行萃取精制，通過改變乙醇和分相鹽的添加量，使目標(biāo)物花色苷在上層有機(jī)相富集，多糖等雜質(zhì)則主要集中在下層水相，從而實現(xiàn)精制花色苷的目的。試驗結(jié)果表明，選擇硫酸銨作為分相鹽，添加量為5.5 g，乙醇與水的體積比為1：1，花色苷和多糖分離效果最好，花色苷萃取率為96.43%。此方法具有操作簡單、分離效果好、有機(jī)相易回收、成本低等優(yōu)點，此外雙水相萃取條件溫和，有利于分離過程中花色苷的穩(wěn)定性。
花色苷在溶解狀態(tài)下穩(wěn)定性較差，易受溫度、pH、光照等外界因素的影響，穩(wěn)定劑（或輔色劑）可通過離子相互作用、疏水作用及范德華力與花色苷形成穩(wěn)定性強(qiáng)的復(fù)合物，防止親核集團(tuán)的攻擊而褪色。研究表明，丙二酸和Mri2+可以作為穩(wěn)定劑提高花色苷的穩(wěn)定性，且在低pH條件(pH 2，3)下花色苷的穩(wěn)定性較好。以花色苷保存率為響應(yīng)值，在單因素試驗基礎(chǔ)上，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面分析試驗。結(jié)果表明，影響花色苷穩(wěn)定性的因素主次順序為：丙二酸濃度>pH> Mn2+濃度，最優(yōu)條件為：丙二酸濃度88 mmol/L，Mn2+濃度6.2 mmol/L，pH 2.6，在此條件下花色苷保存率為79.21%，較空白對照組穩(wěn)定性提高了近2倍。
4評述
采用乙醇／鹽雙水相體系對牡丹花色苷進(jìn)行萃取精制，分別考察分相鹽和乙醇的添加量對花色苷和多糖分離效果的影響。結(jié)果表明，選擇硫酸銨作為分相鹽，添加量為5.5 g，乙醇與水的體積比為1:1，在此條件下花色苷和多糖分離效果最好，花色苷萃取率為96.43%。進(jìn)一步考察有機(jī)酸、金屬離子、pH對牡丹花色苷穩(wěn)定性的影響。研究表明，丙二酸和Mn2+對花色苷有輔色效果，可以提高花色苷的穩(wěn)定性，低pH條件(pH 2，3)下花色苷的穩(wěn)定性較
好；以花色苷保存率為響應(yīng)值，在單因素試驗基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗。試驗優(yōu)化結(jié)果為：丙二酸濃度88 mmol/L,Mn2+濃A6.2 mmol/L，pH 2.6，在此條件下花色苷保存率為79.21%,較空白對照組穩(wěn)定性提高了近2倍。
