典型加油站土壤中微生物豐度及群落多樣性
茍雅玲， 王東， 楊蘇才*， 宋云， 王海見， 李佳斌
（輕工業(yè)環(huán)境保護研究所，工業(yè)場地污染與修復北京市重點實驗室，北京100089）
摘要：包氣帶是泄漏油品進入地下水的通道，存在多種類型的微生物。研究油品泄漏場地包氣帶土壤中微生物豐度及群落多樣性特征，可為加油站場地土壤和地下水的微生物修復提供理論依據(jù)。該研究基于土壤DNA提取，16S r DNA實時定量PCR( polymerasechain reaction)和克隆文庫的構建，分析了加油站土壤中微生物豐度及群落結構特征。實時定量PCR結果表明，表層土壤微生物豐度高于深層土壤約2個數(shù)量級，未污染深層土壤中微生物豐度高于污染的深層土壤約2個數(shù)量級。RDP( ribosomal database project)分析結果表明，加油站場地表層土壤微生物種類較豐富，而深層土壤微生物組成較單一，且污染的深層土壤細菌群落多樣性明顯低于對照場地深層土壤。研究也發(fā)現(xiàn)，與汽油降解相關的微生物菌群Beta-proteobacteria是深層污染土壤的主導微生物。
關鍵詞：污染場地；土壤；微生物豐度；群落結構
中圖分類號：X172doi:10.3969/j.issn．1003-6504.2016.06.001
文章編號：1003-6504,(2016)06-0001-06
我國目前已有加油站10余萬座，僅北京市現(xiàn)有加油站就達1081座。由于埋地油罐和輸油管線腐蝕或超齡使用已造成加油站油品泄漏問題日趨突出。截止2014年，美國已確認有近50萬個埋地油罐存在泄漏，約為埋地油罐總量的1／4。殼牌公司在英國的加油站約有1/3已對當?shù)赝寥篮偷叵滤斐闪宋廴�，類似情形在捷克、匈牙利等國都有發(fā)生。國內尚未對加油站油品泄漏問題進行過系統(tǒng)調查，但發(fā)現(xiàn)部分建設時間較早的加油站已開始泄漏，并對地下水造成污染。如前些年北京市安家樓和六里屯加油站發(fā)生過嚴重漏油事故，曾一度迫使附近的自來水廠停止運行(http：//finance.ifeng.com/news/corp orate/20110828)。為此國務院常務會議于2011年討論通過的《全國地下水污染防治規(guī)劃（2011-2020年）》高度重視加油站場地污染修復工作。
包氣帶是指地面以下潛水面以上的地帶，是大氣水和地表水同地下水發(fā)生聯(lián)系并進行水分交換的地帶，是由礦物質和有機物質組成的固體物質、氣體和水分占據(jù)的固體顆�？紫兑约岸喾N具有活性的微生物構成的復雜有機整體。當油品類污染物進入包氣帶后，土壤對污染物的吸附作用可使部分污染物滯留在土壤中。另外，微生物對有機污染物適應性的遺傳機制表明，污染環(huán)境中的微生物之間可以發(fā)生水平基因轉移或在微生物的染色體內進行基因重排、突變、復制，可以形成能夠降解有機污染物的優(yōu)勢菌群。因此，長期受油品污染的土壤中可能存在能夠降解油品的微生物，可部分降解進入包氣帶土壤中的油品。因此，研究油品泄漏場地包氣帶土壤中微生物豐度和群落多樣性，有助于揭示包氣帶對油品類有機污染物的自然降解機制，可為加油站場地地下水保護提供理論依據(jù)。
本研究以某汽油泄漏的加油站場地為研究對象，通過實時定量PCR和克隆文庫等現(xiàn)代分子生物學方法考察土壤微生物豐度和群落結構，為汽油污染土壤和地下水的微生物修復提供科學依據(jù)。
1材料與方法
1.1土壤樣品的采集與保存
土壤樣品于2013年3月采集自華北某加油站及附近區(qū)域。該加油站1992年開始運營，2011年發(fā)現(xiàn)該加油站存在泄漏現(xiàn)象，隨后利用傳統(tǒng)方法和快速調查評估方法對該場地進行了詳細的污染調查評估，證實存在汽油泄漏，并確認了土壤的污染范圍和程度。本研究中，在地下儲油罐和加油機附近設置了2個采樣剖面（A點和B點）。用水鉆破開采樣剖面上方的水泥層后，在A和B2個采樣點分別采集了表層土壤(0~0.2 m)，編號記為AT和BT，深層土壤(5.8-6.0 m)，編號記為AS和BS。在加油站附近選取一無污染的土壤取樣點CK，取樣深度為表層(0～0.2 m，CKT)，深層(5.8～6.0 m，CKS)。用于揮發(fā)性有機污染物(volatile organic compounds，VOCs)測試的樣品在現(xiàn)場用VOCs專用采樣器將土壤樣品加入到事先稱重的含有10 m L甲醇的40 m L頂空瓶中，立即封蓋，保存于帶有冰袋的樣品保存箱中，帶回實驗室立刻分析測試；用于提取土壤DNA的土壤保存于帶有冰袋的樣品保存箱中，帶回實驗室保存于-20℃，以便后續(xù)分析測試；其余的土壤保存于4℃以便分析土壤理化性質（表1）。
1.2土壤中特征污染物含量的測定
用于苯、甲苯、乙苯、苯乙烯、二甲苯、三甲苯、甲基叔丁基醚等VOCs以及TPH( total petroleum hydro-carbons)(C6-C9)分析測試的土壤樣品的采集、保存和運輸參照US.EPA 5035A方法，分析測定采用吹脫捕集／氣相色譜-質譜法。
1.3微生物豐度分析
用MOBIO PowerSoil DNA Isolation Kit土壤DNA提取試劑盒提取土壤DNA，操作步驟按照試劑盒說明進行。以16S r DNA基因作為靶基因，利用實時熒光定量PCR對細菌基因群落的豐度進行檢測。定量PCR反應在iC ycler IQ5 (Bio -Rad，USA)儀器上進行。探針和引物由北京諾賽生物工程公司完成，探針為5端以FAM（6-carboxy-fluorescien）標記作為熒光報告染料，3 端以TAMRA(6-carboxy-tetra-methylrhodamine)標記作為熒光淬滅染料。細菌的16S rDNA基因的擴增應用引物BACT11369F/PROK1492R和探針TM1389F，使用Premix remix Ex
TaqlM(TaKaRa)試劑盒(TaKaRa．Japan)。定量PCR產物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測特異性。每個循環(huán)中熒光收集在83℃下進行，排除由于引物二聚體的存在所引起的誤差。設置溶解曲線以檢測擴增產物的特異性，其反應程序在55～99℃之間，每0.5℃讀數(shù)，其間停留10 s。起始模板濃度由Ct值確定。數(shù)據(jù)分析采用儀器自帶軟件iCycler(version l.0.1384.0 CR)進行分析。
1.4克隆文庫的構建和序列分析
以土壤樣品提取所得的DNA為模板，對所得16S rDNA基因片段采用TaKaRa Agarose Gel DNAPurification Kit Ver.2.0( TaKaRa)切膠純化，具體操作按照產品說明書進行，最后用50 VL滅菌水洗提。將純化后的DNA片段通過pGEM-T Easy Vector SystemI( Promega)試劑盒連接在載體上，轉化感受態(tài)大腸桿菌細胞( JM109)( TaKaRa)，涂布到含有氨芐青霉素( Ampicillin )/IPTGIX-Gal的LB( Luria-Bertani)培養(yǎng)基上，37℃下培養(yǎng)16～24 h。隨機選取一定數(shù)量的白色克隆子，采用菌體直接擴增方式，用pGEM-TEasy Vector通用引物T7/SP6擴增外源插入片段，用T7/SP6進行擴增反應，反應條件如下：94℃下5 min，隨后35個循環(huán)包括94℃下30 s，50℃下30 s，72℃下45 s，最后是72℃下延伸5 min。通過電泳的方法檢驗含有插入片段的克隆子。在RDP( RibosomalDatabase Project)數(shù)據(jù)庫(http://rdp.cme.msu.edu/
index.jsp)中對16S rDNA序列進行分類，使用treeBuilder軟件構建了系統(tǒng)發(fā)育樹。
2結果與討論
2.1 土壤污染特征
AT和BT 2組表層土壤汽油特征污染物的含量低于方法檢測限（表2），但深層檢測出汽油特征污染物，濃度為45.64～73.68 mg/kg。并且B點污染物濃度高于A點。對照場地中CKT、CKS加油站特征污染物含量低于檢測限。由于該加油站地下儲油罐位于地下3m處，故汽油污染物的泄漏主要發(fā)生在地下3m左右。前期工作表明，該汽油污染場地3～5 m以下的土壤以砂土和粉土為主，非常利于汽油在重力的作用下向下遷移擴散；同時，較低的土壤有機碳含量導致吸附在土壤顆粒和孔隙中的污染物量有限。所以，該場地AS和BS 2組深層土壤檢出汽油特征污染物。表層AT和BT 2組土壤樣品未檢出特征污染物，是由于汽油垂直向上的遷移擴散被上層存在的黏土層阻隔，污染物未能遷移至表層土壤中。
2.2土壤細菌豐度
土壤樣品AT、AS、BT、BS、CKT、CKS的細菌定量分析結果（圖1）表明，加油站場地內表層土壤AT和BT的細菌log拷貝數(shù)分別為(6.96+0.09)和(7.48+0.03)，深層土壤AS和BS的細菌log拷貝數(shù)分別為( 4.98+0.31)和(5.29+0.30)。表層土壤的細菌豐度遠遠高于深層土壤AS和BS的細菌豐度（約2個數(shù)量級）。對照場地土壤CKT的細菌豐度為(9.02+0.05)（log拷貝數(shù)），也高于深層土壤CKS的細菌豐度(log拷貝數(shù)為(7.42+0.02))。此外，加油站表層土壤的細菌豐度與對照場地深層土壤的細菌豐度相當�？偟膩碚f，表層土壤的細菌豐度高于深層土壤，具有水泥覆蓋層的表層土壤的細菌含量遠低于無水泥層覆蓋層的對照場地表層土壤，未污染的深層土壤中細菌豐度高于污染的深層土壤。
Fierer等對加利福尼亞州的一處凍融土壤剖面進行微生物量分析，結果顯示深層土壤(2m)的微生物密度比表層土壤(25cm)低1～2個數(shù)量級。許多學者也在其他土壤剖面中觀察到相似的微生物豐度模式，認為微生物數(shù)量隨著剖面深度的增加而降低。表層土壤微生物含量高于深層土壤，可能是表層土壤總有機碳量高于深層，并且C/N也高于深層土壤，而可利用碳影響微生物群落數(shù)量的垂直分布。本研究中，表層土壤樣品的有機碳含量均不同程度地高于深層土壤有機碳含量，微生物含量也高于深層，說明土壤中有機碳量和微生物量有緊密的聯(lián)系。污染場地土壤細菌含量低于對照土壤，可能是由于污染物進入土壤后，改變了土壤的生物毒性，抑制了某些微生物的生長。
2.3微生物群落多樣性
土壤微生物群落多樣性，是指土壤微生物群落的種類和種間差異，微生物群落多樣性包括物種多樣性、遺傳多樣性及生理功能多樣性等。微生物群落多樣性的研究可以通過分析土壤中細菌種類、豐度分布均勻性，了解土壤污染前后微生物多樣性變化。本研究選取CKT、CKS、AT、AS、BT、BS的土壤樣品建立克隆文庫，CKT、CKS、AT、AS、BT、BS測序97～99
個克隆�；诳寺∥膸斓腞DP分析結果見圖2。CKT測得的序列可歸人13個細菌類群（門），Beta-proteobacteria是主要的類群(29%)，其次是Acidoba-cteria (27%)、Gamma-proteobacteria( 9%)、Sphingoba-cteria( 7%)、Actinobacteria( 4%)等。CKS測得的序列可歸入7個細菌類群（門），Beta-proteobacteria是主要的細菌類群(65%)，其次是Gamma -proteobacteria(24%)、Alpha-proteobacteria( 7%)等。AT測得的序列可歸入12個細菌類群（門），Beta-proteobacteria是主要的細菌類群(24%)，其次是Bacilli( 12%)、Actino -bacteria(8%)、Alpha-proteobacteria( 8%)、Gamma-pro-teobacteria( 7%)等。AS測得的序列可歸入2個細菌類群（門），Beta-proteobacteria是主要的細菌類群，其相對豐度約占98%。BT測得的序列可歸人12個細菌類群（門），Actinobacteria是主要的細菌類群(45%)，其后依次為Alpha-proteobacteria( 15%)、Beta -proteo -bacteria( 11%)、Bacilli( 10%)等。BS測得的序列主要是Beta-proteobacteria，其相對豐度為99%。
到目前為止，研究人員在等還原條件下已分離出多種能高效降解苯系物（苯、甲苯、乙苯、二甲苯）和烷烴的微生物菌群（表3）。這些微生物大多屬于Beta-proteobacteria。本
研究中，加油站場地表層土壤微生物種類較豐富，而深層土壤微生物組成較單一，主要為Beta-proteo -bacteria，此外，受汽油污染的深層土壤中Beta-proteo-bacteria占絕大多數(shù)，而未受污染的對照場地除Beta-proteobacteria外還有'Gamma-proteobacteria和Alpha-proteobacteria，可能是由于在污染物的脅迫下，部分對汽油污染物敏感的微生物種群無法適應環(huán)境，其數(shù)量逐漸減少。Sutton等和宋佳宇等對柴油和汽油污染場地微生物群落的研究也分別發(fā)現(xiàn)相似現(xiàn)象。微生物在汽油污染的環(huán)境中發(fā)生基因重排、突變和復制后，可能形成能夠降解有機污染物的優(yōu)勢菌群，有利于污染物的微生物降解。
3結論
本研究選取加油站AT、AS、BS、BT和對照場地CKT、CKS的土壤提取DNA，應用實時熒光定量PCR和基于克隆文庫的RDP測試分別分析了土壤中微生物豐度與群落多樣性。分析結果表明：(1)表層土壤的細菌豐度高于深層土壤，具有水泥覆蓋層的表層土壤的含量遠低于無水泥層覆蓋的對照場地表層土壤。(2)未受汽油污染的深層土壤中細菌豐度高于受污染的深層土壤。(3)污染土壤細菌群落多樣性明顯低于對照場地土壤，與汽油降解相關的微生物菌群是Beta-proteobacteria，在汽油污染環(huán)境中大量繁殖、富集，逐漸成為場地中的優(yōu)勢菌群。
