烤鴨水提物細胞抗氧化活性的研究
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周小理，王雨薔，唐文，謝凡，周一鳴*
上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院香料香精技術(shù)與工程學(xué)院（上海201418）
摘要試驗以傳統(tǒng)名食烤鴨為原料，重點對其水溶性提取物的細胞抗氧化活性進行了研究。試驗通過水溶提取、凝膠層析(葡聚糖凝膠G15)分離烤鴨中的活性物質(zhì)，并對其對細胞(胃癌細胞，MGC-803)增殖和細胞內(nèi)抗氧化酶活性的影響進行了研究，并同時選取最優(yōu)組分進行細胞氧化損傷模型的建立。試驗結(jié)果表明：烤鴨粗提取物和經(jīng)凝膠層析純化得到的4種組分（D1，D2，D3和D4）對細胞增殖能力及抗氧化酶活性等指標有較好的提升作用，其中組分D3最大程度地促進了細胞增殖，提高了細胞中抗氧化酶(SOD)的活性，并且對過氧化氫誘導(dǎo)損傷細胞具有明顯的保護作用。
關(guān)鍵詞 烤鴨：水溶提取物；凝膠層析；細胞抗氧化
烤鴨作為中華民族的傳統(tǒng)名食，主要分為北京烤鴨和廣式烤鴨，其中北京烤鴨最負盛名，是中華民族飲食文化的瑰寶�？绝喚哂袪I養(yǎng)全面、蛋白含量豐富，含有多種營養(yǎng)素等特點�，F(xiàn)今市面所售烤鴨多采用掛爐烤制工藝，烤制前需經(jīng)涂糖處理，烤制溫度和時間控制在230℃～250℃、30～50 min，這為美拉德反應(yīng)的發(fā)生提供了基礎(chǔ)條件。美拉德反應(yīng)作為食品
加工中普遍存在的非酶褐變反應(yīng)，是食品中羰基化合物（糖類）和氨基化合物（蛋白質(zhì)）所發(fā)生的反應(yīng)。美拉德反應(yīng)不僅能顯著改善食物的特性，如風(fēng)味、色澤等，同時美拉德反應(yīng)產(chǎn)物( Maillard reaction products，MRPs)還具有一定的抗氧化活性，有些產(chǎn)物甚至可媲美于食品中常用的抗氧化劑。不僅如此，MRPs還具有一定的細胞活性（細胞抗氧化等），有研究發(fā)
現(xiàn)人參皂苷與絲氨酸反應(yīng)產(chǎn)物( MRPs)就具有很強的自由基清除能力，并且還具有保護腎上皮細胞免受鉑誘導(dǎo)細胞損傷的活性。另外，Hao等研究也發(fā)現(xiàn)不同種類的糖與酪蛋白反應(yīng)產(chǎn)物( MRPs)具有抑制偶氮二異丁脒鹽酸鹽( Azo two isobutyl acetamipridhydrochloride．AAPH)損傷Caco-2細胞的活性。
目前，對于烤鴨的研究大多集中于香氣成分的分析，研究發(fā)現(xiàn)烤鴨的主要香氣成分為醛類、吡嗪類、呋喃類（糠醛、2-戊基呋喃）和噻唑類。這些物質(zhì)中也不乏有美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的香氣成分�，F(xiàn)今，對于烤鴨水溶性提取物的活性研究并不多見，且對于肉制品活性成分提取方法的應(yīng)用更是少之又少。Broncano等采用樣品水溶提取、離心、過濾、濾膜除鹽以及膜超濾（3 kDa以下）等方法提取了發(fā)酵香腸中低分子的抗氧化活性物質(zhì)。Gu等利用超濾、凝膠色譜分離了酪蛋白一葡萄糖模式美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。Zhou等利用水溶提取、凝膠分離制得的烤鴨的水溶性粗提物及其分離組分具有一定的生物活性（抗氧化活性），同時液相色譜分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取物中含有糠醛、HMF和吡嗪等美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。因此可認為水溶提取、凝膠分離的方法可以獲得含有MRPs的烤鴨水溶性提取物。針對上述研究現(xiàn)狀，試驗開展了對烤鴨水溶性生物活性物質(zhì)的提取分離及細胞抗氧化活性的研究。
1 材料與方法
1.1材料與試劑
烤鴨：上海市售；噻唑藍( MTT)：Sigma公司；人體胃癌細胞（MGC-803）：中國科學(xué)院細胞庫；RPMI1640細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液、胎牛血清：HyClone公司；總蛋白、丙二醛( Malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶( Superoxide Dismutase，SOD)、一氧化氮( Nitric Oxide，NO)、一氧化氮合成酶(NitricOxide Synthase，NOS)測定試劑盒：南京建成生物工程公司；Sephadex G-15:上海寶曼生物科技有限公司。
1.2儀器與設(shè)備
凝膠層析裝置：上海青浦滬西儀器廠；多功能酶標儀( Infinite M200 Pro)：Tecan公司；倒置顯微鏡( IX71)：Olympus公司；紫外分光光度計( UV2600)：島津企業(yè)管理（中國）有限公司。
1.3試驗方法
1.3.1烤鴨水溶性粗提物的制備及純化
稱取一定量的烤鴨水溶性粗提物，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液。采用Sephadex G-15( 1.5 cm×40 cm)凝膠過濾層析，紫外檢測器檢測波長為280 nm，洗脫液為超純水，流速1 mL/min，分部收集器收集后，低溫濃縮、冷凍干燥后（烤鴨水溶性純化物）冷藏待用。
1.3.2細胞培養(yǎng)
人體胃癌細胞（MGC-803）于5% CO2、37 0C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3 d更換一次新鮮培養(yǎng)液。進行細胞試驗時，需利用血球計數(shù)板調(diào)整細胞濃度后進行試驗。
1.3.3烤鴨水溶性純化物對細胞增殖能力及細胞內(nèi)活性指標（SOD，MDA，NO和NOS）的影響
參照LV等的方法，細胞以4×105個/mL接種于96孔板，每孔200 μL。試驗組分別添加不同質(zhì)量濃度的樣品培養(yǎng)液（0.5，1，2和4 mg/mL），培養(yǎng)24 h后，MTT法測定烤鴨水溶性純化物對細胞增殖能力的影響。細胞以2 x 104個/mL接種于12孔板，添加最優(yōu)濃度的樣品培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞24 h，終止培養(yǎng)后，吸盡培養(yǎng)液，用PBS清洗。利用-80℃低溫冰箱反復(fù)凍融細胞獲得裂解液，根據(jù)試劑盒說明書測定蛋白含量及細胞中SOD，MDA，NO和NOS等活性指標的活力和含量。
1.3.4細胞氧化損傷模型的建立
1) H2 O 2細胞損傷試驗。細胞接種于96孔板，每孔200μ L。分別加入含有不同濃度H2 O 2的新鮮培養(yǎng)液，利用MTT法測定細胞增殖率，選取IC50濃度的H2O2進行細胞損傷保護作用的試驗。
2)分離物對H2O2氧化損傷細胞保護作用的研究。細胞接種于96孔板，空白對照組：細胞不做任何處理；損傷組：加入合適濃度的H2O2損傷細胞；加樣組：分離組分D3培養(yǎng)細胞22 h后加入合適濃度的H2O2損傷，MTT法測定細胞增殖率。
2試驗結(jié)果與討論
2.1凝膠層析
圖1為粗提物( D0)經(jīng)凝膠色譜分離得到4個組分，分別命名為D1，D2，D3和D4。如圖所示，根據(jù)出峰的先后順序可知分離物各組分分子量大小順序為D1> D2> D3> D4。
2.2烤鴨水溶性純化物細胞抗氧化活性的研究
2.2.1對細胞增殖能力及細胞中活性指標的影響
圖2為MTT法測定的不同質(zhì)量濃度(0.5，1，2和4 mg/mL)烤鴨水溶性純化物對MGC-803細胞增殖能力的影響，由圖2中可以看出，在一定濃度范圍內(nèi)樣品對細胞增殖有顯著的促進作用，其中D3作用尤其明顯，且在質(zhì)量濃度<2 mg/mL時，質(zhì)量濃度越高，促進細胞增殖的效果越明顯。
圖3是質(zhì)量濃度為2 mg/mL時烤鴨水溶性純化物對細胞內(nèi)SOD，MDA，NO和NOS指標的影響，由圖3可以看出，與對照組相比，經(jīng)D3處理過的細胞MDA含量最低，SOD活性較對照組高，NO的含量、NOS的活力較對照組低，且均呈現(xiàn)顯著變化。
2.2.2細胞氧化損傷模型的建立
圖4為水溶性純化物D3對H2O2細胞損傷模型的細胞抗氧化活性影響。首先，由圖4 (a)可知，隨著濃度的增加，H2O2對細胞的損傷程度也不斷增加，當濃度為25μmol/L時，細胞穩(wěn)定性降到一半左右，因此選擇25μmol/L的H2O2進行細胞損傷模型試驗；其次，由圖4(b)可知，不同濃度的D3均可減小H2O2對細胞增殖的抑制作用，使細胞存活率由41.1%增加到92.3%。結(jié)果表明，烤鴨水溶性純化組分D3具有較好的細胞抗氧化活性。
3結(jié)論與討論
在正常的人體細胞中，細胞的氧化與抗氧化始終處于動態(tài)平衡之中。該平衡一旦被打破，活性氧( Reactive oxygen species，ROS)就會增多而攻擊細胞磷脂層中的多不飽和脂肪酸，最終產(chǎn)生MDA，加劇氧化損傷細胞而導(dǎo)致細胞凋亡；不僅如此，細胞除了受刺激產(chǎn)生ROS外，還能自分泌一定量的ROS。同時細胞中也存在多種清除ROS的酶，如SOD等，也會不斷地清除活性氧。TNOS代表細胞中總NOS，包括TNOS（原生型酶）和TNOS（誘導(dǎo)型酶），細胞中NOS酶是NO合成的關(guān)鍵酶，在受到外界刺激時，體內(nèi)的細胞如肝細胞、巨噬細胞等可表達TNOS，而產(chǎn)生遠高于生理量的NO，抑制能量代謝及干擾糖酵解、三羧酸循環(huán)引起細胞凋亡，因此一氧化氮合酶( NOS)同樣也是檢測細胞活力及損傷的重要指標。試驗結(jié)果表明烤鴨水溶性粗提物和凝膠層析純化的4種組分均具有提高細胞活力及細胞內(nèi)抗氧化酶( SOD)活性的能力，同時也可減低細胞內(nèi)MDA的含量，其中組分D3的作用最為明顯。D3是通過提高細胞中SOD的酶活、降低細胞自分泌的ROS、減少自由基和細胞中MDA的含量，從而提高細胞增殖能力（活力）。朱振勤等研究發(fā)現(xiàn)10μg/m L的白蘆藜醇培養(yǎng)細胞后，可使細胞內(nèi)源SOD活性升高(200.2%)，可使Hela細胞內(nèi)自分泌的總ROS濃度降低(46.5%)，進而確定了白蘆藜醇的細胞抗氧化功能。H2O2細胞損傷模型試驗也說明組分D3確實對H2O2損傷細胞具有保護作用，即表現(xiàn)出良好的細胞抗氧化能力。
烤鴨水溶性粗提物和凝膠層析純化物所具有的細胞抗氧化活性，主要來自烤制過程中所產(chǎn)生的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，即MRPs具有一定的細胞抗氧化活性。這一結(jié)果與大米淀粉與葡萄糖等價物及葡萄糖反應(yīng)產(chǎn)生的MRPs對H2O2損傷Caco-2細胞的保護作用有許多的相似之處，其機理主要為抑制細胞凋亡因子，增強細胞內(nèi)抗氧化酶的活性兩個方面。同時又與Esmaeili
等研究的鼠尾草提取物細胞抗氧化機理相一致，即測定提取物培養(yǎng)細胞后細胞內(nèi)SOD等活性指標的變化，證實了提取物是通過提高細胞活力及細胞內(nèi)抗氧化酶的活性（SOD活性提高66.7%）來發(fā)揮細胞抗氧化功能，進而保護細胞免受氧化損傷。試驗對進一步研究烤鴨中的生物活性物質(zhì)提供了有利的理論依據(jù)。
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