不同窖齡窖泥原核生物多樣性的高通量測(cè)序研究
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李克亞1，文章1，鄧斌2．李周1，胡承1*
1．四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（成都610064）：
2．重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院（重慶401121）
摘要窖池環(huán)境和其中多樣的微生物構(gòu)成了濃香型大曲酒發(fā)酵的特殊生態(tài)系統(tǒng)，其中蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源。試驗(yàn)通過對(duì)兩個(gè)酒廠的新老窖池的不同取樣位置的窖泥樣品進(jìn)行基于Illumina Miseq平臺(tái)對(duì)細(xì)菌V3可變區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序并結(jié)合理化性質(zhì)的測(cè)定，研究各窖泥樣品原核生物的群落結(jié)構(gòu)，以及窖泥理化性質(zhì)和窖泥中所含放線茵豐度的聯(lián)系。研究結(jié)果初步表明，窖池老熟過程本質(zhì)上是窖泥理化性質(zhì)與其中微生物群落多樣性交互作用的過程。
關(guān)鍵詞 窖泥；多樣性分析；豐度；高通量測(cè)序；原核生物
釀造濃香型大曲酒需要經(jīng)過窖池發(fā)酵這一過程，窖泥是各種微生物進(jìn)行發(fā)酵、代謝的場(chǎng)所，濃香型大曲酒生產(chǎn)采用全泥窖發(fā)酵，酒質(zhì)直接與窖泥質(zhì)量相關(guān)。在窖內(nèi)微生物作用下，人窖糟醅發(fā)酵正常會(huì)使其香氣就更濃郁，酒體也會(huì)豐厚飽滿，形成濃香型大曲酒“窖香濃郁，綿甜醇厚”的獨(dú)特風(fēng)格。新窖池微生物類群繁雜不穩(wěn)定富集有限，新泥味重，新窖池產(chǎn)酒很多香味不協(xié)調(diào)，口感較差；老窖池的窖泥微生物豐富，酶系復(fù)雜，馴化成熟，年份越久的老熟窖池越容易產(chǎn)出酒質(zhì)穩(wěn)定、品質(zhì)優(yōu)良的原酒。
隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的蓬勃發(fā)展，為群落多樣性、物種豐度提供了越來越豐富的研究方法。高通量測(cè)序作為“下一代”測(cè)序技術(shù)近年來迅速發(fā)展起來，它具有測(cè)序準(zhǔn)確率高、耗時(shí)短以及信息處理量大等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合生物信息學(xué)的數(shù)值分析，能科學(xué)地表征或預(yù)測(cè)微生物的群落結(jié)構(gòu)。試驗(yàn)結(jié)合考察了不同窖齡窖池理化性質(zhì)趨勢(shì)性改變和其中原核生物類群與含量，討論了窖池老熟過程與窖池放線菌豐度變化可能存在潛在關(guān)系。研究通過Miseq平臺(tái)高通量測(cè)序分析了兩個(gè)廠的新老窖泥原核生物的含量和豐度，探究放線菌的含量與窖池各項(xiàng)理化指標(biāo)的關(guān)系，提出了放線菌豐度作為窖池性能指標(biāo)的可行性。
1 材料與方法
1.1材料、試劑及儀器
供試樣品：成都蜀之源酒業(yè)（以下簡(jiǎn)稱A酒廠）窖齡為5年、20年的封窖泥、窖壁泥和窖底泥；四川豐谷酒業(yè)（以下簡(jiǎn)稱B酒廠）窖齡為5年、30年的封窖泥、窖壁泥和窖底泥。每個(gè)樣品取樣采用五點(diǎn)混合并混勻的方式，取樣后樣品于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?1個(gè)樣品及樣品編號(hào)見表1。
土壤細(xì)菌總DNA提取試劑盒：北京，天根；TaqMaster Mix: Vazyme，南京；San Prep柱式DNA膠回收試劑盒：Sangon，上海；DNA marker 2000: BioTeke，北京；其他生化試劑為分析純。
離心機(jī)：TGL-16B．上海安亭科學(xué)儀器廠；電泳儀：BG-Power 600，北京白晶生物技術(shù)有限公司；PCR儀：MG-96G，杭州明基科學(xué)儀器有限公司；紫外凝膠成像系統(tǒng)：BIO-RAD，USA。
1.2理化指標(biāo)測(cè)定與方法
含水率：分別取一定量的樣品稱量，電熱烘箱內(nèi)105℃將樣品烘干至絕干，再次稱量計(jì)算含水率。
吸水性：分別取適量各窖泥樣品，105℃烘干樣品后，碾磨樣品至泥土組分成粉末或小顆粒狀，20目過篩除去泥樣中的酒糟。再于105℃烘箱中烘干恒重。每個(gè)樣品各稱取Sg于培養(yǎng)皿中，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱，條件為40℃、濕度95%、12 h。每隔th重新稱量，直至質(zhì)量不再增加。
pH：規(guī)定土壤pH為土壤與水1:1懸浮液pH，通過酸度計(jì)直接讀取pH。
腐殖質(zhì)含量：采用冷凝回流提取腐殖質(zhì)，提取的腐殖質(zhì)用重鉻酸鉀容量法測(cè)定。
1.3 土壤細(xì)菌總DNA提取
將窖泥解凍后分別取等量(0.3 g)樣品使用土壤基因組DNA提取試劑盒提取總DNA，每個(gè)樣品提取3個(gè)重復(fù)用于保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。用1.5%的瓊脂糖膠電泳和V3區(qū)預(yù)擴(kuò)增檢測(cè)DNA的大小與片段完整性，總DNA于-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>
1.4樣品16S rDNA V3可變區(qū)的擴(kuò)增和高通量測(cè)序
選用細(xì)菌16S rDNA通用引物，F(xiàn)端加barcode序
1.5群落組成分析
基于Miseq平臺(tái)的測(cè)序得到的每個(gè)窖泥樣品文庫(kù)的OTU豐度信息，從而可以獲得各分類水平下各類群的豐度含量。其中考察每個(gè)樣品中放線菌群在測(cè)序樣本中的占比，探索窖泥放線菌豐度與取樣位置和窖齡長(zhǎng)短的相關(guān)性。
1.6窖泥原核生物多樣性分析
根據(jù)對(duì)物種多樣性研究的尺度范圍不同，物種多樣性可分為a多樣性、β多樣性和y多樣性。a多樣性主要關(guān)注局域均勻生境下的物種數(shù)目，即生境內(nèi)的多樣性；β多樣性指沿環(huán)境梯度不同生境群落之間物種組成的相異性或物種沿環(huán)境梯度的更替速率，也被稱為生境間的多樣性；y多樣性描述區(qū)域或大陸尺度的多樣性，是指區(qū)域或大陸尺度的物種數(shù)量，也被稱為區(qū)域多樣性。評(píng)估群落a多樣性采用對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法，借助抽選測(cè)序的序列數(shù)與它們所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建稀釋性曲線。有多種指數(shù)可評(píng)估物種的a多樣性，如Shannon-Wiener指數(shù)、Gleason指數(shù)、Margalef指數(shù)、Pielou均勻度指數(shù)、種間相遇機(jī)率( PIE)指數(shù)和Simpson多樣性指數(shù)等。其中，Shannon-Wiener指數(shù)利用各樣品的測(cè)序量在不同測(cè)序深度時(shí)的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，以此 反映各樣品群落的異質(zhì)性，Shannon-Wiener指數(shù)計(jì) 算在不同測(cè)序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性，測(cè)序量越大 Shannon-Wiener指數(shù)反應(yīng)的多樣性越準(zhǔn)確。Simpson 多樣性指數(shù)表征在無(wú)限大小的群落中隨機(jī)取樣得到同樣的兩個(gè)樣本屬不同種的概率，值越大說明群落多樣性越大。
1.7主成分分析
主成分分析( Princ,ipal component analysis，PCA)，通過線性變換從多個(gè)變量中選出較少個(gè)數(shù)重要變量的一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法。為了進(jìn)一步提煉Miseq平臺(tái)測(cè)序數(shù)據(jù)提供的有價(jià)值信息，對(duì)各窖泥樣品原核生物OTU組成進(jìn)行分析并相似聚類，可以反應(yīng)出各窖泥樣品間的差異和距離。
2結(jié)果與討論
2.1各窖泥樣品理化性質(zhì)
細(xì)胞中的各種生理生化反應(yīng)都必須有水的參與才能進(jìn)行，窖泥中的水分保障了其中微生物能正常進(jìn)行必要的生理代謝調(diào)節(jié)。窖泥中水分的含量高低在一定程度上影響著窖泥質(zhì)量的好壞。水分過低，窖泥板結(jié)會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)繁殖；水分過高又影響窖泥中一些微生物代謝，還會(huì)引起窖泥的黏著力下降。無(wú)論水分過高或過低都會(huì)影響窖泥質(zhì)量從而影響出酒質(zhì)量。因此適度的水分含量是窖泥老熟的重要因素。如圖1(A)所示，兩廠老窖池的含水量均低于新窖池；圖1(B)中，隨著窖齡增加，窖泥（尤其是窖底泥）的吸水率表現(xiàn)出明顯下降，窖泥吸水率降低使得酒醅由經(jīng)窖泥滲透失水降低，同時(shí)減少了酒精和香味物質(zhì)等隨著水分一起流失。pH會(huì)影響微生物代謝過程中一些酶的活性，過高或過低的pH都會(huì)限制微生物生長(zhǎng)代謝。優(yōu)質(zhì)窖泥的pH-般在5～7范圍內(nèi)，由圖1(C)可見，除封窖泥pH略高，為中性或弱堿性，A、B兩廠新窖池pH較低，老窖池pH高于新窖池，達(dá)到了一般優(yōu)質(zhì)窖池的弱酸性pH范圍。圖1(D)~(E)分別給出了A、B兩酒廠各新老窖泥樣品中腐殖質(zhì)的含量，老窖泥的中層和底層窖泥的腐殖酸含量都低于新窖泥。
2.2 窖泥總DNA的提取
使用土壤細(xì)菌總DNA提取試劑盒共提取11個(gè)泥樣的總DNA，共33份，電泳結(jié)果以及DNA的濃度檢測(cè)顯示平行樣品的結(jié)果較一致。測(cè)序共獲得47483條原始序列。測(cè)序量最低的為B酒廠30年窖池封窖泥，最高的為B酒廠30年窖池中層窖壁泥。99%以上序列的凈長(zhǎng)度在300～420 b p之間，細(xì)菌16S rRNA基因V3區(qū)的平均長(zhǎng)度為180 b p，試驗(yàn)的測(cè)序長(zhǎng)度能覆蓋V3區(qū)全長(zhǎng)。
2.3群落組成分析
采用RDP classifier對(duì)序列進(jìn)行分類地位的鑒定，發(fā)現(xiàn)窖泥樣品中的序列主要來自于變形菌門( Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門( Bacteroidetes)、廣古菌門(Euryarchaeota)、放線菌門( Actinobacteria)、WWE1、疣微菌門( Verrucomicrobia)、綠彎菌門(Chloroflexi)、柔壁菌門( Tenericutes)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)和泉古菌門( Crenarchaeota)等（見圖2）。其中，變形菌門和厚壁菌門在各樣本中含量占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，與變形菌門和厚壁菌門多是營(yíng)兼性或者專性厭氧及異養(yǎng)生活相對(duì)應(yīng)。其中，厚壁菌門在新老窖池的中層窖泥和窖底泥中的含量有明顯差異，均是老窖池中相對(duì)含量更高。
圖3為各窖泥樣品中測(cè)序檢出序列中放線菌所占豐度，A酒廠新老封窖泥放線菌豐度明顯高于其他樣品，與放線菌是好氣菌有關(guān)。放線菌更適于生長(zhǎng)在中性或微堿性環(huán)境中，結(jié)合圖1(C)和圖3可以看出，放線菌豐度除了與窖池位置相關(guān)外，與各其所在環(huán)境pH具有明顯相關(guān)性。從新老窖池水平看放線菌豐度規(guī)律不明顯，A酒廠中層新窖窖池窖泥中放線菌含量高于老窖池，而在新窖池窖泥在底層的放線菌含量又低于老窖池；B酒廠中層新窖窖池窖泥中放線菌含量低于老窖池，而在新窖池窖泥在底層的放線菌含量則很接近。放線菌是產(chǎn)生土腥素的主要來源，從生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)上看來，老窖的土腥味往往低于新窖，故推斷新窖的放線菌豐度應(yīng)該更高。試驗(yàn)測(cè)得放線菌總豐度與窖齡長(zhǎng)短聯(lián)系并不顯著，原因可能是不是所有放線菌都會(huì)釋放土腥素，還可能是老窖中多樣的微生物資源對(duì)腐殖質(zhì)起到分解作用，而并非放線菌豐度降低直接導(dǎo)致。因此放線菌與窖齡長(zhǎng)短的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。
2.4窖泥樣品a多樣性的評(píng)價(jià)
97 010的序列相似度可歸為一個(gè)種，因此將該相似度的序列歸為一個(gè)OTU，檢出各樣品中OTU數(shù)量。如圖4 (A)所示，隨著檢測(cè)樣本量的增加，曲線斜率減小趨于平緩，說明此時(shí)的測(cè)序數(shù)據(jù)量較為合理；且樣品間OTU有較明顯的差異，能體現(xiàn)各窖泥樣品中微生物多樣性的差異。測(cè)序中，最大抽樣測(cè)序片段樣本量為16 429，此時(shí)檢測(cè)到OTU最多和最少的樣品分別是B酒廠30年窖齡的中層窖壁泥(1 532)和B酒廠30年窖齡的封窖泥( 891)，由于封窖泥處于窖池表層，每輪生產(chǎn)封窖增加了與外界接觸的機(jī)會(huì)，引起封窖泥中微生物的含量和種類具有較高的隨機(jī)性。除封窖泥外，OTU最低的是A酒廠20年窖齡窖池的底層窖泥，接下來是B酒廠30年窖齡窖池的底層窖泥，故老窖池的底層窖泥趨于含有較少的類群數(shù)目。其余樣品檢出OTU數(shù)較為接近，OTU介于1 300~1 404之間。
根據(jù)97%水平下OTU的豐度信息，使用Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)對(duì)各窖泥原核生物多樣性進(jìn)行評(píng)估。圖4(B)每條曲線代表一個(gè)樣品，初期測(cè)序量遠(yuǎn)不覆蓋樣品，曲線直線上升，當(dāng)測(cè)序量超過1 650以后，曲線逐漸趨于平滑，說明測(cè)序條數(shù)足以覆蓋試驗(yàn)樣品中的大部分窖泥原核生物。從圖4(B)可看出新窖池底層窖泥Shannon-Wiener指數(shù)最高，其群落多樣性最大；老窖池底層窖泥Shannon-Wiener指數(shù)最低，其群落多樣性最小。中層窖壁泥的Shannon-Wiener指數(shù)同樣是新窖池比老窖池高，新窖池體現(xiàn)出更高的群落多樣性。以上數(shù)據(jù)結(jié)果表明：窖池窖齡越接近，其細(xì)菌群落多樣性程度也更相近，試驗(yàn)檢測(cè)的樣品中老窖池的細(xì)菌群落多樣性低于新窖池，體現(xiàn)出窖池微生物群落馴化的過程。圖4(C)中，Simpson指數(shù)曲線也能得到和Shannon-Wiener指數(shù)曲線相似的結(jié)果。
2.5主成分和聚類分析
主成分分析圖是基于每個(gè)樣品中所含有的全部OTU完成的，以百分?jǐn)?shù)的形式體現(xiàn)主成分主要影響程度。如圖5 (A)所示，每個(gè)點(diǎn)代表了一個(gè)樣品，主成分1( PC1)和主成分3(PC3)是造成窖泥樣品差異的兩個(gè)最大特征，貢獻(xiàn)率分別為46.63%和12.09%，兩點(diǎn)之間在橫、縱坐標(biāo)上的距離，代表了樣品受主成分（PC1或PC3）影響下的相似性距離；圖5(B)為聚類分析結(jié)果，用距離長(zhǎng)短直觀反映了各樣品的相似性和差異性。
3結(jié)論
窖池的老熟過程是窖池環(huán)境與窖泥微生物不斷相互作用的過程，窖池熟化過程也富集了窖泥中一些微生物，這些菌群在窖池中生長(zhǎng)代謝也影響了窖泥的性能。窖泥在老熟過程中，水分含量會(huì)發(fā)生改變，供試樣品中老窖泥的含水量和持水率都有所降低，中、底層窖泥pH升高呈弱酸性，腐殖酸含量降低。初步推測(cè)可能的原因是新窖泥初始配方中添加的腐殖酸較豐富。不同窖齡窖池不同位置窖泥的原核生物豐度有所差異，這是生產(chǎn)工藝以及釀造環(huán)境共同作用的選擇結(jié)果，同時(shí)窖池中各菌群生長(zhǎng)代謝也為窖池老熟提供了推動(dòng)力。
試驗(yàn)通過Miseq平臺(tái)高通量測(cè)序技術(shù)，基于V3可變區(qū)的測(cè)序結(jié)果，揭示了兩酒廠不同取樣位置不同窖齡窖泥的細(xì)菌群落多樣性。對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行分類地位的鑒定發(fā)現(xiàn)．窖泥樣品中的序列主要來自于變形菌門( Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門( Bacteroidetes)、廣古菌門(Euryarchaeota)、放線菌門( Actinobacteria)、WWE1、疣微菌門( Verrucomicrobia)、綠彎菌門(Chloroflexi)、柔壁菌門( Tenericutes)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)和泉古菌門( Crenarchaeota)等，其中占絕大多數(shù)的是厭氧菌。多樣性分析和聚類分析給出了樣本間的相似性和差異性。試驗(yàn)為窖泥微生物資源的研究和窖池的老熟程度評(píng)估做了一定探索。
