玉米胚芽蛋白水解物的制備及其抗氧化活性研究
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王文1，黃繼紅1*，楊銘乾1,2，李海月1，紀(jì)小國，
1．河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院（鄭州450001）；2．鄭州市中食農(nóng)產(chǎn)品加工研究院（鄭州450001）
摘要為高效利用脫脂玉米胚芽蛋白，采用雙酶分步酶解制備玉米胚芽蛋白水解液，通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對酶解條件進(jìn)行優(yōu)化;利用膜分離對其進(jìn)行初步純化并測定其體外抗氧化活性。結(jié)果表明，一步酶解的最佳條件：堿性蛋白酶的加酶量為0.58%, pH 8.65，酶解4.78 h時(shí)，蛋白溶出率為57.70%+1.92%;二步酶解的最佳條件：木瓜蛋白酶加酶量0.11%，pH 6.54，酶解2.28后，蛋白溶出率達(dá)88.71%+1.5%；不同分子段蛋白質(zhì)水解物均具有較強(qiáng)的自由基
清除能力和一定的還原力。純化組分中<3 kDa肽段(E1)對超氧陰離子自曲基的清除效果最好，有望作為一種有效的抗氧化肽，在醫(yī)藥、食品和飼料行業(yè)等發(fā)揮應(yīng)用優(yōu)勢。
關(guān)鍵詞雙酶分步酶解；蛋白溶出率；膜過濾：抗氧化活性
玉米胚芽是玉米深加工產(chǎn)業(yè)最具附加值的副產(chǎn)品，脫脂后，其蛋白含量在20%左右，且其氨基酸組成較為均衡，人體必需氨基酸含量高于大豆和小麥中的含量，與FAO/WHO推薦的人類蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)具有很好的一致性。采用蛋白酶水解技術(shù)可有效將其功能基團(tuán)釋放出來。徐力等分離純化玉米胚芽蛋白酶解物，得到結(jié)構(gòu)為Leu-Asp-Tyr-Glu短肽，并驗(yàn)證此短肽具有抗氧化活性。玉米胚芽蛋白酶解物含有豐富的纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸等，可用于生產(chǎn)抗疲勞或運(yùn)動后機(jī)體恢復(fù)的營養(yǎng)補(bǔ)給劑或作為改善肝病、腎病和腸道障礙等患者的補(bǔ)給劑；此外玉米胚芽肽還可制成功能食品，具有降血壓、降膽固醇、抑制腫瘤細(xì)胞增殖的功能。
目前，單酶酶解玉米胚芽蛋白的報(bào)道相對較多，陳彥平、丁繼峰等采用木瓜蛋白酶對玉米胚芽蛋白進(jìn)行酶解，水解度在14%左右。任建等利用2709堿性蛋白酶水解玉米胚芽蛋白，水解度可達(dá)22.46%，但其加酶量(5%)和調(diào)漿用水均較大。單酶酶解普遍存在原料利用率低、產(chǎn)品生理活性弱等問題。但由于酶本身也是蛋白質(zhì)，同時(shí)加入兩種不同的酶，可能引起兩酶間的相互水解，或者不同蛋白酶之間產(chǎn)生競爭性抑制從而影響水解速度，且不同蛋白酶的最佳水解條件存在差異性。因此，試驗(yàn)采用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶分步酶解脫脂玉米胚芽，可有效提高蛋白溶出率；利用膜過濾對水解物進(jìn)行初步的分離后，測定各組分對羥自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除能力及總還原力，分析各水解組分的抗氧化活性，以期獲得一種高抗氧化活性的玉米胚芽肽或酶解組分。
1 材料與方法
1.1試驗(yàn)材料試劑
脫脂玉米胚芽粕（含蛋白18.2%）：湖北常香油脂股份有限公司提供；堿性蛋白酶，木瓜蛋白酶均購于Solarbio公司；鄰二氮菲，鄰苯三酚，GSH等均為分析純。
1.2主要儀器與設(shè)備
雷磁pH計(jì)PHS-3E：上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV-1000紫外分光光度計(jì)：天美（中國）科學(xué)儀器有限公司；半自動凱氏定氮儀：濟(jì)南海能儀器股份有限公司；實(shí)驗(yàn)型膜分離設(shè)備（雙工位平板膜）：賽普（無錫）膜科技發(fā)展有限公司。
1.3試驗(yàn)方法
1.3.1工藝流程
1.3.2蛋白溶出率的測定
按照凱氏定氮法（GB/T 5009.5-2010）測定酶解液和原料中粗蛋白含量，蛋白溶出率的計(jì)算如式1所示。
1.3.3酶解液抗氧化活性測定
包括羥自由基清除能力、DPPH自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力和總還原力的測定。
1.3.4酶解條件的優(yōu)化
1.3.4.1第一步酶解：堿性蛋白酶對玉米胚芽酶解效果的影響
利用堿性蛋白酶對脫脂玉米胚芽粕進(jìn)行酶解后，調(diào)pH 7.0，得混合物A，滅酶離心，測定玉米胚芽蛋白溶出率以評價(jià)酶解效果。分別考察堿性蛋白酶添加量（酶／底物重）(0.2%，0.4%，0.6%，0.8%和1.0%)，酶解時(shí)間（1，2，3，4和5 h）和pH( 7.5，8.0, 8.5，9.0和9.5)對蛋白溶出率的影響。
1.3.4.2第一步酶解：響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)
根據(jù)1.3.4.1單因素試驗(yàn)選擇試驗(yàn)條件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，利用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以加酶量（X1）、酶解時(shí)間（X2）和酶解pH（X3）為試驗(yàn)因素，蛋白溶出率為評價(jià)指標(biāo)，采用三因素三水平的分析方法，對堿性蛋白酶的試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。
1.3.4.3第二步酶解：木瓜蛋白酶對玉米胚芽蛋白酶解效果的影響
將1.3.4.1所得混合物A加木瓜蛋白酶酶解后，調(diào)pH 7.0，滅酶離心，測定玉米胚芽蛋白溶出率。分別考察木瓜蛋白酶添加量(0.04%，0.08%，0.12%，0.16%和0.20%)，酶解時(shí)間(0.5，1.5，2.5，3.5和4.5 h)，pH（5.0，5.5，6.0, 6.5和7.0）對玉米胚芽蛋白溶出率的影響。
1.3.4.4第二步酶解：響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)
根據(jù)1.3.4.3單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用響應(yīng)面法分析加酶量(A)、酶解時(shí)間(B)和酶解pH(c)的最佳值。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表2。
2結(jié)果與分析
2.1第一步酶解：堿性蛋白酶對玉米胚芽蛋白溶出率的影響
2.1.1單因素試驗(yàn)
由圖1可知，蛋白溶出率隨加酶量的不斷增加而升高，當(dāng)加酶量達(dá)0.6%以后，溶出率的變化趨于平緩。這是因?yàn)樵诘孜餄舛纫欢ǖ那闆r下，提供給酶作用的肽鍵數(shù)是一定的，酶量飽和后，加酶量的增大對蛋白溶出率的影響不顯著，最適加酶量在0.60%左右。
由圖2可知，酶解反應(yīng)大致分為兩個(gè)階段，4h之前蛋白溶出率增加迅速，而4h之后，溶出率變化明顯變緩。這可能是由于反應(yīng)剛開始時(shí)，堿性蛋白酶濃度最高，活性最大，因此反應(yīng)速度較快；隨著反應(yīng)的進(jìn)行可參加反應(yīng)的酶量減少，活性下降，反應(yīng)速度放緩，表現(xiàn)為蛋白溶出率幾乎不再增加。因此，堿性蛋白酶的酶解時(shí)間以4h左右為宜。
由圖3可知，玉米胚芽蛋白溶出率隨pH的升高而增加，pH 8.5時(shí)，蛋白溶出率最大，其原因是隨pH的增加，蛋白質(zhì)與水之間的相互作用力增強(qiáng)，蛋白質(zhì)溶解性提高，有利于酶解的進(jìn)行；而當(dāng)pH為8.5～9.5時(shí)，堿濃度過高導(dǎo)致酶解系統(tǒng)黏度增加，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白提取率下降。另外，pH過高容易使蛋白質(zhì)分子脫氨、脫羧、肽鍵斷裂，同時(shí)會發(fā)生“胱賴反應(yīng)”，把氨基酸轉(zhuǎn)化成有毒的化合物，影響酶解物的安全，因此，堿性蛋白酶的最適pH為8.5。
2.1.2響應(yīng)面試驗(yàn)
響應(yīng)值二次模型的方差分析及顯著性如表4所示。由表4可知，模型p<0.000 1，模型極顯著，失擬項(xiàng)p=8 727>0.05不顯著。因此，二次模型成立，可用此模型分析和預(yù)測堿性蛋白酶的酶解條件。分析其顯著性，可知加酶量、酶解時(shí)間及pH對蛋白溶出率影響極顯著；加酶量和酶解時(shí)間的交互作用顯著影響蛋白溶出率。交互作用的響應(yīng)曲面及等高線如圖4所示。
通過Design-Expert軟件分析，由Design-Expert軟件分析出堿性蛋白酶的最佳工藝參數(shù)為：加酶量0.58%、酶解4.78 h、pH 8.65，此時(shí)玉米胚芽蛋白理論溶出率為59.62%，在相應(yīng)條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，此條件下蛋白溶出率為57.70%，實(shí)際值與理論值相近，誤差僅為1.92%，表明模型建立合理，預(yù)測的結(jié)果較為準(zhǔn)確。
2.2第二步酶解：木瓜蛋白酶對玉米胚芽蛋白溶出率的影響
2.2.1單因素試驗(yàn)
由圖5可知，木瓜蛋白酶可顯著增加玉米胚芽蛋白的最終溶出率，考慮酶解效果和酶解成本，選擇0.12%作為最適加酶量。
酶解時(shí)間對蛋白溶出率的影響如圖6所示，在酶解時(shí)間為0.5～2.5 h時(shí)，蛋白溶出率呈直線增加，在2.5～4.5 h內(nèi)，蛋白溶出率基本保持不變。且時(shí)間過長可能導(dǎo)致多肽的過度水解，因此選擇2.5h為最佳酶解時(shí)間。
不同pH對玉米胚芽蛋白溶出效果的影響趨勢如圖7所示，可知pH過大或過小均不利于蛋白的酶解，這可能與玉米胚芽結(jié)構(gòu)改變有關(guān)。因此，木瓜蛋白酶的最適pH為6.5。
2.2.2第二步酶解：響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)
利用Design-Expert 8.0.6軟件對表5中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到加酶量(A)、酶解時(shí)間(B)和pH對蛋白質(zhì)溶出率(Y)的影響的預(yù)測方程
由回歸方差分析（表6）可知，模型p=0.000 1，極顯著；方程失擬項(xiàng)p=0.190 6>0.05不顯著，試驗(yàn)誤差小，說明模型擬合可靠。方程一次項(xiàng)A、B、C極顯著，二次項(xiàng)A2、C2極顯著，B2顯著，交互項(xiàng)AC、BC不顯著，AB顯著。因此，各試驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，表明回歸模型的意義和真實(shí)度良好，加酶量、酶解時(shí)間和酶解pH對蛋白質(zhì)溶出率的影響極為顯著；加酶量和酶解時(shí)間兩因素間的交互作用顯著。交互作用的響應(yīng)曲面及等高線如圖8所示。
通過Design-Expert軟件分析，預(yù)測出木瓜蛋白酶的最佳工藝參數(shù)為加酶量0.11%，酶解時(shí)間2.28 h，pH6.54，蛋白質(zhì)溶出率的最大預(yù)測值為90.06%，在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，蛋白質(zhì)溶出率約88.71%，試驗(yàn)誤差僅為1.5%，接近模型預(yù)測蛋白質(zhì)溶出率。
2.3抗氧化試驗(yàn)結(jié)果
研究表明，10 kDa以下肽類均對機(jī)體具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用和抗氧化活性；Jumeri等以海鞘為原料制備的分子量在5.0±1.0 kDa，3.6±0.1 kDa的肽類具有較強(qiáng)的抗氧化和抗腫瘤活性。也有資料表明，分子量在2.5～3 kDa的肽類具有較為理想的抗氧化能力，但多肽的抗氧化活性主要與暴露的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)和肽序列有關(guān)。
2.3.1 自由基清除能力的測定
玉米胚芽蛋白富含具有生物活性的氨基酸序列。由圖9可知，各組分均具有較好的自由基清除能力。濃度均為1 mg/m L時(shí)，五種樣品的羥自由基清除率均高于GSH，是GSH清除能力的1.22～1.54倍；而分子量小于3 kDa的玉米胚芽肽在5種樣品中具有最強(qiáng)的DPPH自由基和超氧陰離子自由基清除能力，分別為GSH清除能力的0.6倍和1.12倍。可知，小于3 kDa肽樣的自由基清除能力與GSH基本相當(dāng)，證明以脫脂玉米胚芽粕為原料制備抗氧化活性肽的方法是可行的。
2.3.2總還原力的測定
總還原力常用來評價(jià)天然抗氧化劑給出電子或給出氫的能力。由圖10可知，30～100 k Da樣品的還原力最高，但僅達(dá)到GSH的41.78%，這可能與樣品中有效抗氧化肽的含量有關(guān)。
3結(jié)論與展望
通過雙酶分步酶解玉米胚芽蛋白，單因素、響應(yīng)面試驗(yàn)及實(shí)際試驗(yàn)驗(yàn)證，確定酶解玉米胚芽蛋白的最佳工藝條件為：堿性蛋白酶加入量0.58%，pH 8.65，酶解4.78 h后；再加0.110%的木瓜蛋白酶，pH 6.54，酶解2.28 h后，玉米胚芽蛋白溶出率高達(dá)88.71%±1.5%，溶出率與一步酶解相比提高31%左右。膜過濾和抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，玉米胚芽蛋白酶解物和各純化組分均具有較好的抗氧化活性；其中小于3 kD a肽段(E1)對超氧陰離子自由基的清除效果最好，作為天然的抗氧化物，E1具有低毒高效的優(yōu)勢，有望在醫(yī)藥、食品和飼料行業(yè)等發(fā)揮應(yīng)用優(yōu)勢。
雖然試驗(yàn)較為系統(tǒng)的制備了玉米胚芽蛋白酶解物，并對不同分子量段酶解物進(jìn)行了抗氧化活性測定，但抗氧化肽（<3 k D a肽段）分子量的準(zhǔn)確確定及抗氧化機(jī)理等還需進(jìn)一步研究。
