91精品人妻互换日韩精品久久影视|又粗又大的网站激情文学制服91|亚州A∨无码片中文字慕鲁丝片区|jizz中国无码91麻豆精品福利|午夜成人AA婷婷五月天精品|素人AV在线国产高清不卡片|尤物精品视频影院91日韩|亚洲精品18国产精品闷骚

 劉鵬鵬，尚才人，黃建鋒，周志南，吳淵，姜侃*

 浙江省質(zhì)量檢測科學研究院（杭州310018）

摘要建立一種快速準確鑒定鴕鳥肉的方法。根據(jù)鴕鳥特異基因(NCBI序列號：AB254879)設計引物，運用PCR技術(shù)擴增鴕鳥特異基因，并驗證方法的特異性和靈敏度。所設計的引物特異性良好，鴕鳥肉DNA擴增后產(chǎn)生112 b p的特異性條帶，而其他肉類未見該特異性條帶；該方法在核酸水平檢出限為0.01 n g，樣品水平檢出限為0.1%。該方法快速準確、具有較高的特異性和靈敏度，可為鴕鳥肉鑒別真假提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞  聚合酶鏈反應；鴕鳥源成分；摻假；檢測

  隨著時代進步，消費者對肉類營養(yǎng)及品質(zhì)的要求變得更高。鴕鳥肉營養(yǎng)豐富，具有極高的營養(yǎng)價值，低脂肪、低膽固醇、低熱量，可減少心血管疾病和癌癥的發(fā)生。加之鴕鳥無疫情侵害，鴕鳥肉已成為國際公認的綠色健康食品。近年來國內(nèi)人工飼養(yǎng)鴕鳥成為新興的畜牧產(chǎn)業(yè)，但由于人工飼養(yǎng)鴕鳥規(guī)模仍比較小，鴕鳥肉價格比其他肉制品高出許多，受利益驅(qū)使不良商家以成本低廉的肉冒充鴕鳥肉，嚴重損害消費者利益，對市場秩序造成不良影響。因此建立一套快速、準確的鴕鳥肉鑒定方法成為當務之急。

 目前，肉品種類鑒定主要方法大致可分為兩類，一類是以蛋白質(zhì)為基礎，另一類則以核酸為基礎。以蛋白質(zhì)為基礎的方法是利用免疫分析法檢測特異性蛋白質(zhì)，通過抗體及抗原的特異性結(jié)合來判讀結(jié)果，常用的方法有酶聯(lián)免疫分析法(Enzyme-linked immunesorbent assay，ELISA)、蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)、對流免疫電泳(Counter immune electrophoresis，CIE)及層析分析法（Chromatography）等，但此法受限于產(chǎn)品因受熱、加壓及化學處理后蛋白質(zhì)變性，導致目標蛋白無法檢出。而以核酸為基礎的分析法主要是利用雜交法( Hybridisation)、限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應( Polymerase chain reaction restrictionfragment length polymorphism．PCR-RFLP)、聚合酶鏈反應( Polymerase chain reaction，PCR)及實時定量聚合酶鏈反應( Real-time PCR)來達到定性及定量的目的，其中PCR因具有特異性、高靈敏性及快

速性的優(yōu)點，較其他方法廣泛應用于肉類品種鑒定分析。

 試驗以鴕鳥肉為研究對象，設計特異引物組，并用其他肉制品混合鴕鳥肉進行檢測，建立鴕鳥肉鑒別方法，以期作為我國建立鴕鳥肉定性鑒定分析方法提供參考依據(jù)。

1  材料與方法

1.1材料與試劑

 RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒：TAKARA；2×Taq PCR Master Mix:  Tiangen;瓊脂糖：法國Biowest。試驗所需鴕鳥肉、雞肉、鴨肉、豬肉和牛肉：市售。

1.2儀器與設備

 Veriti梯度PCR儀：美國ABI公司；基礎電泳儀：美國Bio-Rad公司；自動凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司；DU730核酸蛋白分析儀：美國Backman公司。

1.3方法

1.3.1引物設計

 根據(jù)鴕鳥特異基因（NCBI序列號：AB254879）

1.3.2  RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

  按照試劑盒說明書提取樣品RNA，分光光度計測試OD260及OD280的，反轉(zhuǎn)錄得到的c DNA于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3  PCR反應條件

1.3.4特異性試驗

 取鴕鳥肉、雞肉、鴨肉、豬肉、牛肉和羊肉分別按1.3.2進行c DNA制備，并按照1.3.3進行PCR反應，反應結(jié)束后，電泳并照相保存。

1.3.5靈敏度試驗

 將提取后的鴕鳥c DNA經(jīng)梯度稀釋后濃度為100，10，1，0.1和0.01 n g，作為檢測模板，按1.3.3建立的方法進行試驗，在核酸水平上確定方法檢出限。

1.3.6混合肉樣檢出限的測定

 為了確定該檢測方法在樣品水平對混合量的檢測極限值，將鴕鳥肉分別與牛、豬、雞、鴨肉混合均勻，制成含鴕鳥肉成分分別為1%，0.1%和0.01%的混合樣，每種混合樣制備1 000 g，以1.3.2介紹的方法提取混合肉樣DNA作為模板，以1.3.3建立的方法進行試驗。

2結(jié)果與分析

2.1  PCR鑒定鴕鳥成分的特異性

 結(jié)果如圖1所示，鴕鳥肉樣品可觀察到產(chǎn)物大小為112 b p的特異性條帶，牛、豬、雞和鴨肉均沒有該特異條帶，說明試驗所設計的引物不會與其他產(chǎn)生交叉反應。結(jié)果表明，試驗所建立的PCR體系可正確擴增出預期產(chǎn)物且具有良好的特異性。

2.2  PCR鑒定鴕鳥成分的靈敏性  

結(jié)果如圖2所示，可觀察到產(chǎn)物大小為112 b p的特異性條帶，隨著核酸濃度減少，其條帶越來越暗且較細。當反應體系中DNA模板為0.01 n g時，經(jīng)PCR擴增電泳后，仍可見明顯特異性條帶，方法檢測限可達0.01n g。

2.3混合肉樣檢出限

  結(jié)果顯示，在牛、羊、雞和鴨肉中含有1%、0.1%鴕鳥肉時，檢測體系均能準確給出檢測結(jié)果。但當鴕鳥肉含量為0.01%時，特異性條帶不明顯。說明鴕鳥源性檢測體系對肉制品摻雜比例檢測極限可達0.1%。

3結(jié)論與討論

 幾年來，肉制品中動物源成分的摻假現(xiàn)象屢見不鮮，嚴重的損害了消費者的消費權(quán)益，影響著市場秩序。動物源成分的鑒定顯得越來越重要，針對市場上常見的雞、鴨、鵝、牛、羊、豬、馬、驢和兔等成分鑒定，國家已制定了相應的檢測標準。鴕鳥肉因其營養(yǎng)價值高消費市場越來越大，市場上以廉價肉冒充鴕鳥肉的現(xiàn)象層出不窮，而針對鴕鳥肉成分的鑒定仍鮮見文獻報道，鴕鳥肉鑒定方法的落后嚴重影響了鴕鳥肉制品的監(jiān)管。

 PCR因具有特異性、高靈敏性及快速性的優(yōu)點，較其他方法廣泛應用于肉類品種鑒定分析。試驗運用PCR技術(shù)原理，根據(jù)鴕鳥特異基因序列（NCBI序列號：AB254879）設計引物，擴增電泳后結(jié)果表明，所設計引物特異性良好，不與其他肉類產(chǎn)生交叉反應。本研究分別在核酸和樣品水平對方法的檢出限進行研究，結(jié)果表明該方法在核酸水平上檢測靈敏度可達0.01 n g�；旌先鈽訖z測結(jié)果顯示，鴕鳥源性檢測體系對肉制品摻雜比例檢測限可達0.1%。該方法檢測限與同類方法檢測限基本一致，能滿足肉類摻假中肉種類的鑒定。

  試驗建立的鴕鳥源鑒定方法具有較高的特異性和靈敏性，操作簡單、快速準確，可為食品監(jiān)管部門鑒別真假鴕鳥肉提供技術(shù)支持。另外，該方法只是建立了鴕鳥肉鑒定的定性方法，如何定量檢測鴕鳥肉成分的含量成為接下來研究方向和重點。