苯并[a]芘對刺參SOD和CAT酶活性影響研究
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魏海峰1，2， 劉長發(fā)1，2， 劉遠1,2， 劉楊1,2
（1．大連海洋大學(xué)海洋科技與環(huán)境學(xué)院，遼寧大連116023；2．遼寧省高校近岸海洋環(huán)境科學(xué)與技術(shù)重點實驗室，遼寧 大連 116023）
摘要：研究究實驗室條件下刺參（Stichopus japonicus）暴露于不同濃度苯并[a]芘后，刺參體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)的變化規(guī)律。實驗設(shè)置了 4個處理組(1.5.10.20 μg/L).空白對照組和丙酮溶劑對照組，在染毒2 h、6 h、12 h.24 h、2 d.4 d、7 d、14 d和21 d取樣分析，其巾第14天放入清潔海水中恢復(fù)7d，分析了苯并[a]芘與刺參SOD.CAT之間的劑量、時間-效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果表明，在苯并[a]芘作用下，刺參的SOD酶活性在第6小時、12小時和21天時與苯并[a]芘濃度呈顯著負相關(guān),R6h=0.959 2(P<0.05).R12h=0.9458( P<005)、R21d=0.959 6( P<0.05)。刺參CAT的誘導(dǎo)隨水體苯并[a]芘濃度的升高而增強，在第2天、第4天有顯著的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)分別為R2d =0.790 6( 0.01P<0.05) .R4d =0.953 3( 0.01P<0.05)，由此表明，在苯并[a]芘染毒作用下，刺參組織解毒代謝指標(biāo)SOD和CAT都出現(xiàn)了明顯的時問一劑量效應(yīng)，經(jīng)相關(guān)性分析提出刺參組織SOD和CAT酶活力可以作為評價苯并[a]芘污染的生物標(biāo)志物。
關(guān)鍵詞：苯并[a]芘；刺參；超氧化物歧化酶(SOD)；過氧化氫酶(CAT)
中圖分類號：X172doi：10.3969/j.issn．1003-6504.2016.04.007 文章編號：1003_6504(2016)04-0031-04
人們對石油的需求量越來越多，海上運油、管道鋪設(shè)也隨之增多，溢油事件頻發(fā)。例如渤海海域溢油事故、大連新港管道爆炸導(dǎo)致的溢油事故等給海洋生物帶來了嚴重危害。溢油產(chǎn)生的有機污染物是一類毒性極大的環(huán)境污染物，具有難降解、高脂溶性、可以在食物鏈中富集放大等特點，能夠通過各種傳輸途徑進行長距離遷移。苯并[a]芘是溢油后重要的代謝產(chǎn)物，對海洋生物具有顯著的毒性影響，研究有機污染物對海洋經(jīng)濟生物環(huán)境毒理學(xué)可以為環(huán)境質(zhì)量評價和風(fēng)險評估提供重要參考依據(jù)。超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，這些酶在生物體受到外界環(huán)境脅迫的情況下可以有效清除機體產(chǎn)生的自由基，從而保護有機體。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等酶活性早已證實可
作為環(huán)境監(jiān)測和環(huán)境污染的早期生物預(yù)警信號，并為海洋有機污染環(huán)境生態(tài)風(fēng)險評價提供參考數(shù)據(jù)。
刺參（Stichopus japonicus）因其經(jīng)濟價值高、繁殖速度快、在我國北方地區(qū)廣泛養(yǎng)殖，但是隨著環(huán)境污染頻發(fā)，環(huán)境污染物導(dǎo)致刺參大面積死亡時有發(fā)生，因此研究污染物特別是多環(huán)芳烴類污染物對刺參的毒性成為水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的研究熱點，使得刺參成為一種理想的生態(tài)毒理研究模式生物。本實驗以刺參為實驗動物，研究了不同濃度的苯并[a]芘對刺參SOD、
CAT酶活性的影響，以期從分子水平全面了解苯并[a]芘引起刺參的生理生化的生物響應(yīng)，從而為海洋環(huán)境的生態(tài)風(fēng)險評估提供科學(xué)的依據(jù)。
1材料和方法
1.1儀器與試劑
儀器：751型紫外分光光度計（上海精科），5415R型臺式離心機（Eppendorf公司）。
試劑：苯并[a]芘化學(xué)試劑為色譜純，純度96%，購自Sigma公司。
1.2 實驗動物和暴露實驗設(shè)計
刺參購自大連海寶漁業(yè)有限公司，離水體長(2.48+0.05) cm，健康有活力。實驗海水為砂濾海水，并用水質(zhì)分析儀進行水質(zhì)檢測，確定此曝氣水適用于本實驗，在120 cmx60 cm x 60 cm的玻璃缸循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)馴養(yǎng)7d，水溫(15±1)℃，早晚定時投喂刺參飼料2次。苯并[a]芘用丙酮配成一定濃度的儲備液，避光保存。實驗容器為1L玻璃燒杯，設(shè)置4個質(zhì)量濃度組(1、5、10、20 μg/L)及一個空白對照組和一個丙酮對照組。分別于暴露2h、6h、12 h、24 h、2d、4d、7d、14 d取樣，于-80℃冰箱保存，在暴露14 d后，將不同濃度組的刺參均在砂濾海水中凈化7d后，采樣測定SOD、CAT酶活性。
1.3樣品制備
取冷凍的刺參組織樣品((0.1±0.01)g)加5 m L預(yù)冷的生物勻漿液于組織勻漿機中勻漿2 min，然后立即進行冷凍離心，分別測定組織液的SOD、CAT酶活性。
1.4指標(biāo)測定方法
SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測定，CAT采用紫外吸收法測定。
1.5數(shù)據(jù)處理
通過Excel數(shù)據(jù)處理軟件，并制表分析。采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件，在P=0.05的置信水平對SOD活性的變化情況進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，并用Sigmaplot 12.5軟件繪圖。
2結(jié)果
2.1 SOD酶活性結(jié)果
苯并[a]芘對刺參SOD的誘導(dǎo)是個動態(tài)變化的過程，處理組與對照組相比，普遍出現(xiàn)了抑制現(xiàn)象，并且在第6小時、12小時和21天時出現(xiàn)了顯著劑量一效應(yīng)關(guān)系，見圖1。濃度和時間是影響誘導(dǎo)活性的重要因素。在時間一效應(yīng)關(guān)系方面，刺參SOD酶活性總體呈現(xiàn)出
抑制狀態(tài)，除第2小時和2天苯并[a]芘處理組與對照組表現(xiàn)為無明顯差異，第24小時20μg/L表現(xiàn)為極顯著抑制，抑制率達到64.5%。從整個實驗數(shù)據(jù)來看，各時間點處理組沒有表現(xiàn)出明顯誘導(dǎo)，此結(jié)果表明，刺參SOD酶在受到苯并[a]芘的刺激下，酶的活性被緩慢抑制，到24 h達到最大抑制率，而后有所恢復(fù)但依然表現(xiàn)為抑制效果。在第14～21天的恢復(fù)期，除了1yg/L處理組恢復(fù)到對照組水平外，5、10、20μg/L處理組的SOD酶的活性并沒有完全恢復(fù)，依然表現(xiàn)為抑制效果，說明苯并芘濃度超過1μg/L，刺參染毒時間超過14 d后，SOD酶的自我修復(fù)能力受到破壞。
劑量效應(yīng)方面，刺參的SOD酶活性與苯并[a]芘濃度，在第6小時、12小時和21天時，呈顯著負相關(guān)，(R6 h =0.959 2(P<0.05)、R12 h =0.945 8(P<0.05)、R21 d=0.959 6(P<0.05))，見圖2。
2.2 CAT酶活性實驗結(jié)果
苯并[a]芘對刺參CAT酶活性顯現(xiàn)出了顯著的誘導(dǎo)效應(yīng)，并且在CAT酶活性與苯并[a]芘第2天、4天的處理組出現(xiàn)了顯著的劑量一效應(yīng)關(guān)系，見圖3。在時間一效應(yīng)關(guān)系方面，CAT活性總體呈現(xiàn)出“鐘形”變化趨勢。其中在第2天各濃度梯度（1、5、10、20μg/L）總體呈現(xiàn)出最大活性，在第14天達到最低。此結(jié)果表明，刺參CAT酶在受到苯并[a]芘的刺激下，酶的活性立刻被誘導(dǎo)，達到較高活性，而后受到抑制逐漸降低，隨著染毒時間的增加，酶的活性逐步恢復(fù)，在達到較高活性后，受到抑制逐漸降低。經(jīng)過7d恢復(fù)，CAT酶的活性逐步達到對照組水平值。本實驗采用了丙酮作為空白對照，其中在第4天20 μg/L濃度組出現(xiàn)最大的誘導(dǎo)率，其值為41.2%；在第14天15L.Lg/L濃度組和20 μg/L濃度組均出現(xiàn)最大抑制率，其值為5.2%。在第2小時，10 μg/L組與丙酮呈現(xiàn)出顯著性差異，在第4天時，10、15和20 μg/L處理組組均與丙酮呈現(xiàn)出顯著性差異。
在劑量一效應(yīng)關(guān)系方面，刺參CAT的誘導(dǎo)隨水體苯并[a]芘濃度的升高而增強，但僅在第2天、第4天有顯著的線性關(guān)系（圖4），其相關(guān)系數(shù)分別為R2d=0.790 6(0.01<P<0.05)，R4d=0.953 3(0.01<P<0.05)。由此可見，高濃度苯并[a]芘誘導(dǎo)CAT的強度高于低濃度。
3討論
(1)以丙酮作為助溶劑與照組相比，刺參SOD和CAT都處于波動中，酶活性變化之間沒有顯著差異，說明丙酮作為助溶劑是可行的。苯并[a]芘對刺參的酶活性都存在抑制作用，污染物在實驗的過程中酶活性都存在“鐘形”的變化趨勢，即酶活性在實驗的某一點達到峰值。
(2)在生物進化過程中，機體為了防御新陳代謝及其他生命活動中，氧自由基的損傷和破壞，相應(yīng)發(fā)展了一套完善的抗氧化防御系統(tǒng)，包括谷胱甘肽(GSH)、維生素C、維生素E、谷胱甘肽(GPx)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)。SOD酶的作用是清除由于污染物脅迫機體產(chǎn)生的O2-和H2O2。從而SOD在脅迫初期SOD活性升高，在污染物脅迫下，抗氧化酶活性可能會出現(xiàn)抑制或者是誘導(dǎo)，誘導(dǎo)或抑制的出現(xiàn)一方面取決于生物體遭受脅迫的強度和時間，另一方面與遭受的生物種類的敏感性有關(guān)。本實驗中刺參SOD和CAT酶活性與定污染物在某些時間段出現(xiàn)了顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，整個實驗過程中SOD和CAT酶活性都是呈現(xiàn)波動狀態(tài)的，因此提示我們未來開展抗氧化酶活性的相關(guān)研究需要既要考慮濃度-劑量關(guān)系，也要考慮時間-劑量關(guān)系。
(3)根據(jù)穆景利等和馮濤等報道，苯并芘[a]可分別誘導(dǎo)黑鯛EROD和大彈涂魚組織SOD活性升高，并且與苯并芘暴露濃度呈現(xiàn)出顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。王淑紅等研究表明熒蒽、菲、芘等多環(huán)芳烴對菲律賓蛤仔消化腺SOD酶活性出現(xiàn)了先誘導(dǎo)，隨后又抑制的實驗現(xiàn)象。吳偉等還發(fā)現(xiàn)在溴氰菊酯暴露25 d內(nèi)，羅非魚肝臟GSH含量表現(xiàn)為先誘導(dǎo)升高，后降低趨勢，與對照存在顯著性差異。本研究表明，刺參SOD酶活性在苯并芘暴露情況下，未出現(xiàn)低濃度的誘導(dǎo)過程，而是在第6小時即出現(xiàn)了抑制現(xiàn)象，除第2天外，其它時間點的SOD均出現(xiàn)顯著的抑制現(xiàn)象，而CAT酶活性與SOD酶活性顯著不同，第2天和4天出現(xiàn)了誘導(dǎo)升高的現(xiàn)象，第14天出現(xiàn)了顯著的抑制過程，經(jīng)過凈化恢復(fù)后，與對照組沒有顯著性差異。
(4)本次實驗，刺參14 d后解除暴露，凈化7d后發(fā)現(xiàn)，各暴露水平中CAT酶活性均下降，與空白對照組沒有顯著性差異，說明設(shè)計的苯并芘暴露濃度對刺參造成的損傷沒有超過自身恢復(fù)能力的范圍，表明在低濃度條件下刺參的CAT酶具有一定的自我修復(fù)能力，該研究結(jié)果與穆景利等的研究結(jié)果相一致。而在同樣濃度條件下SOD酶卻沒有恢復(fù)到空白對照組水平，說明SOD和CAT雖然都是抗氧化酶，但是其自我修復(fù)能力和敏感程度存在一定的差異性。在苯并[a]芘染毒作用下，刺參組織解毒代謝指標(biāo)SOD和CAT都出現(xiàn)了明顯的時間-劑量效應(yīng)性，經(jīng)相關(guān)性分析提出刺參組織SOD和CAT酶活力可以作為評價苯并[a]芘污染的生物標(biāo)志物。
4結(jié)論
本文研究了刺參暴露于不同濃度苯并[a]芘后，SOD和CAT酶活性在不同暴露時間動力學(xué)變化情況，結(jié)果表明，苯并[a]芘可以引起刺參機體SOD和CAT酶活性在暴露21 d內(nèi)出現(xiàn)一定的波動變化，SOD酶活性在苯并[a]芘的脅迫下，出現(xiàn)了顯著的抑制作用，CAT則出現(xiàn)了顯著的誘導(dǎo)效應(yīng)，經(jīng)過一段時間的凈化后，CAT酶活性都恢復(fù)到了正常狀態(tài)，而SOD在高濃度組則出現(xiàn)了不可逆的損傷，因此凈化實驗可以幫助刺參恢復(fù)機體的正常狀態(tài)，其毒性及恢復(fù)機理需要基因毒理學(xué)進一步研究闡述。SOD、CAT酶活性在苯并芘脅迫下，一定時間內(nèi)出現(xiàn)了顯著的劑量一效應(yīng)關(guān)系，可以用于監(jiān)測海洋環(huán)境的苯并[a]芘污染。
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