刺松藻抑藻活性物質(zhì)分離的初步研究
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浦寅芳1， 蘇振霞1， 肖輝2， 張志恒1， 王俊1， 孫穎穎1
（1．淮海丁學(xué)院海洋學(xué)院，江蘇連云港222005;2．江蘇省海洋資源開(kāi)發(fā)研究院，江蘇連云港222000）
摘要：采用甲醇浸泡刺松藻干粉末，適當(dāng)處理后，制備到此海藻的甲醇提取物（過(guò)濾和減壓蒸干）。抑藻活性檢測(cè)表明，當(dāng)濃度為4.0 mg/m L時(shí)，此甲醇提取物明顯抑制了米氏凱倫藻的生長(zhǎng)。進(jìn)一步采用2種液液萃取方法，對(duì)此提取物進(jìn)行分離，共獲得8個(gè)液液萃取分離組分。這些組分對(duì)米氏凱倫藻均表現(xiàn)出抑藻活性。在此基礎(chǔ)上，采用化學(xué)成分系統(tǒng)預(yù)試驗(yàn)方法，初步分析了這些抑藻活性組分的化學(xué)成分。結(jié)果表明，刺松藻甲醇提取物的液液萃取分離組分中主要含有鞣質(zhì)、有機(jī)酸和黃酮。最后，對(duì)抑藻活性組分進(jìn)行了硅膠GF254薄層層析檢測(cè)，得到了較為適宜的展開(kāi)劑，為后續(xù)采用硅膠柱層析進(jìn)行分離純化奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。目前，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)刺松藻抑藻活性物質(zhì)的相關(guān)研究。
關(guān)鍵詞：抑藻活性物質(zhì)；刺松藻；分離；赤潮微藻
中圖分類號(hào)：X172 doi:10.3969/j.issn．1003-6504.2016.04.011 文章編號(hào)：1003-6504(2016)04-0053-05
近年來(lái)，赤潮在全世界范圍內(nèi)頻發(fā)，對(duì)近海水域生態(tài)環(huán)境和沿海水產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展造成了極大的威脅。因此，用于赤潮預(yù)防、控制和減緩(PCM)的技術(shù)和方法引起了科學(xué)界和相應(yīng)管理機(jī)構(gòu)的重視。在這些技術(shù)和方法中，利用大型海藻進(jìn)行赤潮預(yù)防、控制和減緩表現(xiàn)出顯著的應(yīng)用潛力。一系列研究成果表明，利用大型海藻對(duì)赤潮進(jìn)行生物控制的方法顯示出環(huán)境友好和低成本等優(yōu)點(diǎn)，為赤潮防控提供了新的思路、研究方法和方向。
目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些大型海藻對(duì)赤潮微藻生長(zhǎng)的抑制作用。例如，龍須菜（Gracilaria lemaneiformis、羊棲菜（Sargassum fusiforme）、馬尾藻（Sargassum spp.）、蜈蚣藻(Grateloupiafilicina)、石花菜(Gelidium anansii)，孔石莼( Ulva pertusa)和緣管滸苔(Enteromorpha linza)能抑制東海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）、中肋骨條藻（Skeletonema costatum）、塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)和赤潮異彎藻（Heterosigmaakashiwo）的生長(zhǎng)。珊瑚藻（Lithophyllum spp.）和鼠尾藻（Surgassum thunbergii）抑制赤潮異彎藻和中肋骨條藻的生長(zhǎng)。真江籬（Gracilaria verrucosa）和滸苔(Ulva prolifera)抑制米氏凱倫藻（Karenia mikimitoi）
的生長(zhǎng)。然而，目前尚未見(jiàn)刺松藻（Codium fragile）抑制赤潮微藻的報(bào)道。
刺松藻是一種世界性分布的綠藻，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒和抗凝血等作用。本文采用甲醇浸泡刺松藻干粉末，適當(dāng)處理后，采用2種液液萃取方法，對(duì)甲醇提取物進(jìn)行初步分離。抑藻活性檢測(cè)后，采用化學(xué)成分系統(tǒng)預(yù)試驗(yàn)方法，分析抑藻活性組分的化學(xué)成分。最后，進(jìn)行抑藻活性組分的硅膠GF254薄層層析檢測(cè)，獲得了較為適宜的展開(kāi)劑，為后續(xù)采用硅膠柱層析分離純化刺松藻的抑藻活性物質(zhì)奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
米氏凱倫藻（Karenia mikimitoi）由江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室保存，f/2培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為(20+0.1)℃，光照強(qiáng)度40μmol／(m2.s)，光暗比為12:12。
刺松藻半干品來(lái)自于采購(gòu)商，40℃下烘干4d后，粉碎(≤0.3 mm)。
天然海水經(jīng)過(guò)脫脂棉和300目篩絹過(guò)濾，煮沸、冷卻，pH值和鹽度分別調(diào)節(jié)至8.5和30備用（實(shí)驗(yàn)所用海水均做如上處理）。
無(wú)水甲醇、乙酸乙酯和丙酮為分析純。
1.2刺松藻抑藻活性物質(zhì)的提取
500 g刺松藻干粉末，置于5 000 m L錐形瓶中，加入3 000 m L甲醇，常溫、黑暗浸泡。10 d后，濾紙過(guò)濾除去殘?jiān)�，并�?.22μm有機(jī)系濾膜除去顆粒物干擾。40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇，獲得浸膏，即為刺松藻的甲醇提取物( MECF)。取適量提取物進(jìn)行抑藻活性檢測(cè)，其余提取物加入適量蒸餾水，充分振蕩，4℃靜置。12 h后，3 500 r/min下離心15 min，收集上清液，進(jìn)行液液萃取分離。
1.2.1不同極性溶劑液液萃取分離
上清液加入石油醚( 60～90℃)萃取3～4次，上層減壓蒸干得石油醚相浸膏（組分A1），下層40℃減壓蒸發(fā)除去甲醇后，加入適量蒸餾水后，用乙酸乙酯萃取3～4次，減壓蒸干獲得乙酸乙酯相浸膏（組分B1）。下層40℃減壓蒸發(fā)除去甲醇后，加入正丁醇萃取3～4次，減壓蒸干分別得到正丁醇相浸膏（組分C 1）和水相浸膏（組分Dl），4℃保存?zhèn)溆谩?
1.2.2不同pH下乙酸乙酯液液萃取分離
上清液用1.0 mol/L Na OH調(diào)pH至11，乙酸乙酯萃取3次。乙酸乙酯相合并后，40℃減壓蒸干，得浸膏（組分A2）。下層加入1.0 mol/L HC1調(diào)節(jié)pH至7，乙酸乙酯萃取3次后，乙酸乙酯相合并，減壓蒸干得到浸膏（組分B2）。用1.0 mol/L HC1調(diào)下層溶液pH至2，乙酸乙酯萃取3次。上層和下層分別減壓蒸干后，獲得乙酸乙酯浸膏（組分C2）和水相浸膏(組分D2)，4℃保存。
1.3硅膠GF2s4薄層層析檢測(cè)
將刺松藻甲醇提取物的液液萃取分離組分，分別以石油醚：乙酸乙酯(2:1、3:2、1:1、2:3、1:2，V:V)和氯仿：甲醇(16:1、10:1、9:1、8:1、4:1.2:1、1:1，V:V)為展開(kāi)劑，進(jìn)行硅膠GF254薄層層析檢測(cè)，紫外254 nm下觀察。
1.4抑藻活性檢測(cè)
1.4.1刺松藻甲醇提取物的抑藻活性實(shí)驗(yàn)
分別加入一定體積MECF到f/2培養(yǎng)基中，混合均勻后，接種米氏凱倫藻，培養(yǎng)體系總體積為100 m L。米氏凱倫藻接種細(xì)胞數(shù)量為5xl04個(gè)／m L，MECF終濃度依次為0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 mg/m L。同時(shí)，設(shè)定添加相同體積甲醇的對(duì)照組(甲醇加入體積不超過(guò)0.5 m L)，每個(gè)培養(yǎng)瓶設(shè)定3個(gè)平行樣。所有培養(yǎng)瓶置于GX2-260B智能型光照培養(yǎng)箱中，溫度(26±1)℃，
光照強(qiáng)度62μmol/(m2.s)，光暗比為12:12。每天定時(shí)搖動(dòng)培養(yǎng)瓶2次，以防止微藻附壁生長(zhǎng)。每隔1d從培養(yǎng)瓶中取1m L培養(yǎng)液，用Lugol's試劑固定后，計(jì)數(shù)藻細(xì)胞數(shù)量的變化。取樣后向培養(yǎng)瓶中加入1 m L 100倍f/2培養(yǎng)液，以避免營(yíng)養(yǎng)耗盡進(jìn)而影響微藻的生長(zhǎng)。
1.4.2液液萃取分離組分的抑藻活性實(shí)驗(yàn)
將液液萃取分離組分加入到f/2培養(yǎng)基中，混合后，接種米氏凱倫藻，培養(yǎng)體系總體積為40 m L。米氏凱倫藻接種細(xì)胞數(shù)量為（14x104-16x104個(gè)／m L，分離組分終濃度均為1.25 mg/m L。同時(shí)，設(shè)定添加相同體積甲醇的對(duì)照組（甲醇加入體積不超過(guò)0.5 m L），每個(gè)培養(yǎng)瓶設(shè)定3個(gè)平行樣，所有培養(yǎng)瓶置于GX2-260B智能型光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件同上。
1.5化學(xué)成分系統(tǒng)預(yù)試驗(yàn)分析
參照化合物常用化學(xué)鑒定方法，進(jìn)行生物堿、酚酸、脂肪酸、萜類、內(nèi)酯、鞣酸、有機(jī)酸和糖類等8種化合物鑒定試驗(yàn)。
1.6數(shù)據(jù)處理
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件包進(jìn)行獨(dú)立樣本檢 驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，p<0.05為顯著性差異，p<0.01為極顯著 性差異。
微藻生長(zhǎng)抑制率，I=（1-N／N0）x100%，式中，N為處理組藻細(xì)胞數(shù)量（x104個(gè)/m L）；N0為對(duì)照組藻細(xì)胞數(shù)量（x104個(gè)/m L）。
2結(jié)果與分析
2.1刺松藻甲醇提取物的制備及其對(duì)米氏凱倫藻生長(zhǎng)的影響
以15.0 kg刺松藻干粉末為原料，經(jīng)甲醇浸泡、過(guò)濾和減壓蒸干等適當(dāng)處理后，制備到240 g暗綠色甲醇提取物。將適量此提取物溶解于甲醇中，制備濃度為10 g/L母液，進(jìn)行抑藻活性檢測(cè)。
圖1表明，隨濃度增加，甲醇提取物對(duì)米氏凱倫藻生長(zhǎng)的抑制作用明顯(p<0.05)增強(qiáng)。當(dāng)濃度為4.0mg/m L時(shí)，甲醇提取物明顯抑制了米氏凱倫藻的生長(zhǎng)，其對(duì)米氏凱倫藻的生長(zhǎng)抑制率為76.5%(10 d)。
2.2刺松藻甲醇提取物液液萃取分離及其對(duì)米氏凱倫藻生長(zhǎng)的影響
采用2種液液萃取方法，分別對(duì)甲醇提取物MECF (110 g)進(jìn)行分離，共制備到A1、B1、C1和D1以及A2、B2、C2和D2等8個(gè)組分，質(zhì)量依次為25.2、3.3、8.0和12.0 g以及29.4、2.7、3.9和8.1 g，得率見(jiàn)表1。將上述8個(gè)組分重新溶解于甲醇，配制濃度為2 g/L母液，進(jìn)行抑藻活性檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2。
在圖2(a)中，組分A1、B1和D1對(duì)米氏凱倫藻的生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯(p<0.05)的抑制作用。第10天，此3個(gè)組分對(duì)米氏凱倫藻的生長(zhǎng)抑制率在80%以上。同時(shí)可以看出，組分C1也在一定程度上抑制了米氏凱倫藻的生長(zhǎng)。在培養(yǎng)期間，此實(shí)驗(yàn)組藻細(xì)胞數(shù)量低于對(duì)照組。
4個(gè)萃取組分中，組分A2、B2和C2顯著(p<0.05)抑制了米氏凱倫藻的生長(zhǎng)，第10天此3個(gè)組分對(duì)米氏凱倫藻的生長(zhǎng)抑制率超過(guò)75%。同時(shí)可以看出，組分D2對(duì)米氏凱倫藻也表現(xiàn)出一定的抑藻作用，盡管在培養(yǎng)期間，此實(shí)驗(yàn)組藻細(xì)胞數(shù)量逐步增加，但仍然低于對(duì)照組(圖2(b))，在整個(gè)培養(yǎng)期間，其細(xì)胞數(shù)量約為對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量的65%。
綜上，對(duì)刺松藻甲醇提取物的所有液液萃取分離組分進(jìn)行化學(xué)成分系統(tǒng)預(yù)試驗(yàn)分析。
2.3刺松藻甲醇提取物液液萃取分離組分的化學(xué)成分檢測(cè)
由表2可以看出，組分A1含有生物堿、鞣質(zhì)和內(nèi)酯／香豆素，可能含有黃酮，不含蒽醌和萜類／甾體；組分B1含有鞣質(zhì)、黃酮和萜類／甾體，可能含有內(nèi)酯／香豆素和有機(jī)酸，不含生物堿和蒽醌；組分C1含有生物堿、鞣質(zhì)、有機(jī)酸、內(nèi)酯／香豆素、黃酮和萜類／甾體，可能含有蒽醌，不含生物堿；組分D1含有酚類、有機(jī)酸、黃酮、鞣質(zhì)和萜類／甾體，可能含有內(nèi)酯／香豆素，不含生物堿和蒽醌。概括來(lái)講，此4個(gè)分離組分中主要含有鞣質(zhì)、有機(jī)酸、黃酮和內(nèi)酯，香豆素，均不含蒽醌。
表3表明，組分A2含有生物堿、鞣質(zhì)、黃酮和萜類／甾體，可能含有內(nèi)酯／香豆素和蒽醌，不含有機(jī)酸；組分B2含有生物堿、鞣質(zhì)、有機(jī)酸、黃酮和萜類／甾體，可能含有內(nèi)酯／香豆素和蒽醌；組分C2含有酚類、有機(jī)酸、黃酮和萜類／甾體，可能含有內(nèi)酯／香豆素，不含生物堿和蒽醌；組分D2含有酚類和黃酮、可能含有內(nèi)酯，香豆素，不含生物堿、有機(jī)酸、葸醌和萜類，甾體。分析得到，上述4個(gè)分離組分中主要含有黃酮、萜類／甾體、生物堿、酚類、鞣質(zhì)和有機(jī)酸，可能含有內(nèi)/厝豆素。
綜合分析，確定刺松藻中主要含有鞣質(zhì)、有機(jī)酸和黃酮等化合物。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，2種不同分離途徑制備到的組分含有／可能含有或不含有的化學(xué)成分是不同的，我們認(rèn)為這可能與提取條件（溶劑和pH）不同有關(guān)。
2.4刺松藻甲醇提取物液液萃取分離組分的硅膠GF蹦薄層層析檢測(cè)
2種不同途徑制備到的刺松藻液液萃取分離組分進(jìn)行硅膠GF254薄層層析檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表4。每個(gè)液液萃取分離組分獲得了較為理想的薄層層析展開(kāi)，為后續(xù)采用硅膠柱層析進(jìn)行這些組分的分離純化奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
3討論
研究表明，大型海藻直接分泌或體內(nèi)含有能抑制赤潮生物生長(zhǎng)的化感物質(zhì)，例如，多管藻屬Polysiphonialanosa產(chǎn)生的聚酚、海頭紅(Plocamium hamatum)中的單萜、小珊瑚藻（Corallina pilulifera）中的溴仿、裂片石莼（Ulva fascisata）、紅藻Neodilsea yendoana、黃藻CIadosiphon okamuranus、孔石莼和龍須菜(Gracilaria lemaneiformis )中的不飽和脂肪酸、緣管
滸苔的脂肪酸等。
本文采用甲醇浸提，獲得刺松藻提取物MECF。當(dāng)濃度為4.0 mg/m L時(shí)，此提取物明顯抑制了米氏凱倫藻的生長(zhǎng)（圖1）。Jeong等發(fā)現(xiàn)綠藻、褐藻和紅藻門某些海藻的甲醇提取物能抑制多環(huán)旋溝藻（Cochlo- dinium polykrikoides）、長(zhǎng)崎裸甲藻（Gymnodiniummikimotoi）和紅色裸甲藻（Gymnodinium sanguineum）等赤潮微藻的生長(zhǎng)。王仁君等也發(fā)現(xiàn)3種大型海藻緣管滸苔（Ulva linza）、小珊瑚藻（Corallina pilulifera）和鼠尾藻(Sargassum thunbergii)的甲醇提取物對(duì)東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)具有強(qiáng)烈的抑制作用。孫穎穎等研究表明，滸苔（Enteromorphaprolifera）甲醇提取物能明顯抑制米氏凱倫藻（Kareniamikimitoi）、中肋骨條藻（Skeletonema costatum）和塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)的生長(zhǎng)。
進(jìn)一步采用2種液液萃取分離方法，對(duì)甲醇粗提物進(jìn)行了初步分離，共制備到8個(gè)萃取分離組分(表1)，這些組分均對(duì)米氏凱倫藻的生長(zhǎng)表現(xiàn)出了抑制作用。其中，組分A1、B1和D1以及A2、B2和C2的抑藻作用更為強(qiáng)烈。在濃度1.25 mg/m L，它們對(duì)米氏凱倫藻的生長(zhǎng)抑制率超過(guò)75%(10 d)（圖2）。在此基礎(chǔ)上，采用化學(xué)成分系統(tǒng)預(yù)試驗(yàn)方法，對(duì)8個(gè)分離組分的化學(xué)成分進(jìn)行了初步分析。結(jié)果表明，刺松藻甲醇提取物的液液萃取分離組分中主要含有鞣質(zhì)、有機(jī)酸和黃酮（表2和表3）。目前，尚不能確定哪些化學(xué)成分是8個(gè)分離組分抑藻活性的主要原因，需進(jìn)一步分離純化�；瘜W(xué)成分系統(tǒng)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)工作明確了分
離目標(biāo)和重點(diǎn)。
更進(jìn)一步采用硅膠GF254薄層層析對(duì)上述8個(gè)分離組分進(jìn)行初步檢測(cè)，獲得較為理想的展開(kāi)結(jié)果（表4），為后續(xù)采用硅膠柱層析進(jìn)行抑藻活性物質(zhì)的分離純化奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
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