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 張  明  楊仁黨  李知函  楊  飛

 （華南理工大學(xué)制漿造紙工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州，510640）

摘要：殼聚糖經(jīng)冰醋酸溶解、氫氧化鈉堿性潤(rùn)脹和冷凍預(yù)處理后，利用有機(jī)溶劑對(duì)殼聚糖置換脫水，再與2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨( ETA)制備不同取代度的殼聚糖季銨鹽；利用制備的殼聚糖季銨鹽作為抑菌劑對(duì)造紙廠白水中常見(jiàn)的細(xì)菌（如大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等）進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，并與常用抑菌劑進(jìn)行比較，且將其與常用抑菌劑異噻唑啉酮復(fù)配，進(jìn)行大腸桿菌和金黃色葡萄糖球菌抑菌效果實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)用異丙醇對(duì)殼聚糖置換脫水，與空白樣相比殼聚糖季銨鹽得率提高14.3個(gè)百分點(diǎn)，產(chǎn)物得率最高可達(dá)到60. 3%；從實(shí)際抑菌效果及生產(chǎn)成本考慮，最佳底物反應(yīng)比例是n（殼聚糖）：n(ETA)=1：6；殼聚糖季銨鹽也是一種廣譜抑菌劑，在異噻唑啉酮中加入用量20%的殼聚糖季銨鹽，具有最好的復(fù)配抑菌性能。

關(guān)鍵詞：殼聚糖季銨鹽；異丙醇；造紙白水；抑菌效果；復(fù)配

中圖分類(lèi)號(hào)：TS727+．2  DOI:  10. 11980/j．issn．0254-508X．2016. 04. 004

 造紙白水中含有纖維素、半纖維素、木素以及施膠劑、改性淀粉等，這為微生物的生長(zhǎng)繁殖提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)，且封閉白水體系的溫度也適合微生物的生長(zhǎng)繁殖。這會(huì)導(dǎo)致漿料中腐漿的產(chǎn)生，進(jìn)而引起管道堵塞和設(shè)備腐蝕，降低生產(chǎn)效率；同時(shí)腐漿還會(huì)造成孔眼、暗斑等紙病。為解決因造紙生產(chǎn)過(guò)程中微生物生長(zhǎng)而引起的各種問(wèn)題，提高產(chǎn)品質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)連續(xù)高效清潔生產(chǎn)，必須使用抑菌劑對(duì)白水系統(tǒng)中的微生物進(jìn)行抑菌、殺菌控制。目前用在造紙白水中的抑菌劑主要有氧系、氯系、溴系，但大多數(shù)在毒性、可降解性及環(huán)保方面難滿足造紙工業(yè)的生產(chǎn)要求。

 殼聚糖作為一種來(lái)源豐富的生物質(zhì)資源，具有良好的生物相容性、無(wú)毒性、生物降解性和廣譜的抗菌抑菌等性能，其在新型抑菌材料制備、造紙白水處理等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。但殼聚糖存在分子間與分子內(nèi)氫鍵，結(jié)晶度較高，在水中不溶解。為提高殼聚糖的水溶性，以進(jìn)一步改善其對(duì)造紙白水中微生物的抑菌效果，需對(duì)天然的殼聚糖進(jìn)行化學(xué)改性。由于殼聚糖分子鏈上含有氨基、伯羥基和仲羥基等反應(yīng)性官能團(tuán)，可以對(duì)殼聚糖進(jìn)行改性以提高其溶解和抑菌效果。

  本研究以無(wú)毒、綠色、環(huán)保為理念，對(duì)殼聚糖進(jìn)行改性，合成一種抑菌劑——殼聚糖季銨鹽，分析置換脫水劑乙醇、異丙醇對(duì)合成工藝的影響、殼聚糖季銨鹽的抑菌效果和機(jī)理，以及復(fù)配抑菌劑對(duì)白水微生物的抑菌效果。

1實(shí)驗(yàn)

1.1實(shí)驗(yàn)原料

 殼聚糖（CTS，脫乙酰度90. 61%，相對(duì)分子質(zhì)量1.0×105）；2，3．環(huán)氧丙基三甲基氯化銨( ETA)；大腸桿菌( ATCC8739)、金黃色葡萄球菌(ATCC-6538)、綠膿桿菌(ATCC9027)、黑曲霉菌(ATCC-16404)和枯草桿菌(ATCC6633)。

1.2化學(xué)藥品

 置換脫水劑：乙醇，異丙醇。

 常用抑菌劑：異噻唑啉酮，吡啶硫酮鋅，十六烷基三甲基氯化銨。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器

 高速分散機(jī)、反應(yīng)釜、電子分析天平、EV018型掃描電子顯微鏡( SEM)、空氣搖床、壓力蒸汽滅菌鍋、無(wú)菌操作臺(tái)、生化培養(yǎng)箱。

1.4殼聚糖季銨鹽的制備

 將總質(zhì)量為1. 00 kg殼聚糖分多次溶于體積分?jǐn)?shù)為2%的醋酸溶液中，在高速分散機(jī)中完全溶解后滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%的Na OH溶液，調(diào)節(jié)殼聚糖溶液的pH值到10左右，使殼聚糖完全析出，在- 18℃冷凍條件下放置24 h后解凍，用水洗滌至中性。最后，用一定體積的乙醇或異丙醇分批次加入到殼聚糖中進(jìn)行洗滌，置換出殼聚糖中的水。

 將預(yù)處理過(guò)的殼聚糖轉(zhuǎn)移到30 L反應(yīng)釜中，加入異丙醇攪拌分散成漿狀，并按一定比例分多次加入ETA，反應(yīng)條件如表1所示。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻到室溫。真空減壓抽濾，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%的乙醇洗滌（重復(fù)處理3次），干燥得殼聚糖季銨鹽粗產(chǎn)品，將殼聚糖季銨鹽粗產(chǎn)品置于冷凍干燥器中干燥，得殼聚糖季銨鹽精制品。

1.5  殼聚糖季銨鹽取代度的測(cè)定

 稱取0.6 g（精確至0. 001 g）殼聚糖季銨鹽精制品于250 m L錐形瓶中，加入100 m L蒸餾水使其充分溶解，加入5 g/L的鉻酸鉀溶液2 m L，用0.05 mol/L的硝酸銀標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至磚紅色沉淀剛出現(xiàn)即為滴定終點(diǎn)。另取一錐形瓶加入100 m L蒸餾水作空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。每組實(shí)驗(yàn)做3次，取平均值。取代度用式（1）計(jì)算。

1.6殼聚糖季銨鹽抑菌性能檢測(cè)及分析

1. 6.1菌種的活化與計(jì)數(shù)

 制備150 m L液體培養(yǎng)基，滅菌后將冷藏保存的菌種加入到液體培養(yǎng)基中，置于380C空氣搖床中培養(yǎng)12 h，使細(xì)菌濃度約為108 cfu/m L。然后把各菌液分別稀釋至102、104、106、108倍，對(duì)活菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.6.2抑菌實(shí)驗(yàn)

 將不同取代度的殼聚糖季銨鹽精制品、異噻唑啉酮、吡啶硫酮鋅、十六烷基三甲基氯化銨分別配成濃度為100、250、500、750、1000 mg/L溶液。準(zhǔn)確移取0.1  m L菌液均勻地涂在培養(yǎng)基上，再往培養(yǎng)基上加入0.1  m L不同濃度的溶液，將溶液涂勻，每個(gè)濃度制備3個(gè)平行樣。另設(shè)置空白對(duì)照組，涂菌，以等量無(wú)菌水代替上述溶液，處理完后將培養(yǎng)皿放到37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。統(tǒng)計(jì)菌落個(gè)數(shù)，計(jì)算各抑菌劑的在不同濃度下的抑菌率。抑菌率用式(2)計(jì)算。

1.6.3掃描電子顯微鏡分析

 將25 m L 1000 mg/L殼聚糖季銨鹽配制成一定濃度的溶液加入到裝有25 m L -定稀釋度菌液的試管中，設(shè)置空白組，搖床上38℃振蕩處理4h，然后吸取適量液體滴加到鋁箔上，自然風(fēng)干。最后對(duì)鋁箔表面進(jìn)行噴金處理，置于EV0 18型掃描電鏡下，放大不同倍數(shù)進(jìn)行觀察。

1.7  與異噻唑啉酮復(fù)配進(jìn)行抑菌效果檢測(cè)

 在一定量的異噻唑啉酮中分別加入0、10%、20%、30%、40%殼聚糖季銨鹽進(jìn)行復(fù)配，再把復(fù)配抑菌劑配成100、250、500、750、1000 mg/L共5個(gè)濃度，按1.6.2步驟對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌做抑菌實(shí)驗(yàn)。

2結(jié)果與討論

2.1  置換脫水劑對(duì)反應(yīng)的影響

 采用等量異丙醇和乙醇對(duì)經(jīng)過(guò)預(yù)處理的殼聚糖置換脫水，然后與ETA在一定反應(yīng)溫度和時(shí)間下進(jìn)行反應(yīng)，最后得到的產(chǎn)物呈淡黃色，產(chǎn)物得率、取代度如表2所示。由表2可知，殼聚糖未經(jīng)脫水時(shí)，產(chǎn)物得率為46.0%，取代度為0.62，而經(jīng)異丙醇處理后，產(chǎn)物得率能達(dá)到60.3%，取代度達(dá)到0.86，得率提高14.3個(gè)百分點(diǎn)，取代度提高0.24。故對(duì)殼聚糖進(jìn)行置換脫水能明顯提高產(chǎn)物的得率和取代度。出現(xiàn)這種現(xiàn)象主要是由于反應(yīng)體系的水會(huì)使醚化劑水解且產(chǎn)物溶于水后體系黏度會(huì)增大，顆粒會(huì)聚集在一起，阻礙傳熱傳質(zhì)，不利于親和取代反應(yīng)，降低反應(yīng)效率，從而降低產(chǎn)物得率和取代度。另外，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)殼聚糖在反應(yīng)前未經(jīng)脫水處理時(shí)，最后所得的殼聚糖季銨鹽呈淡黃色黏稠狀，產(chǎn)物黏度很大，不易

從反應(yīng)釜中取出，而殼聚糖經(jīng)脫水處理后再與ETA反應(yīng)，所得產(chǎn)物呈淡黃色顆粒狀，黏度很小，易從反應(yīng)釜中取出。故對(duì)殼聚糖進(jìn)行脫水處理，一方面能提高產(chǎn)物得率，另一方面也使產(chǎn)物方便取出，可提高生產(chǎn)效率。

 從表2可以看出，采用乙醇和異丙醇對(duì)殼聚糖進(jìn)行脫水處理都能顯著提高產(chǎn)物得率和取代度，且采用乙醇脫水和異丙醇脫水的產(chǎn)物得率、取代度都相當(dāng)。但采用乙醇脫水時(shí)，脫水后的殼聚糖里殘留有大量乙醇，而乙醇的沸點(diǎn)為78.3℃，當(dāng)反應(yīng)溫度高于78.3℃時(shí)，在反應(yīng)過(guò)程中乙醇會(huì)揮發(fā)出來(lái)，存在安全隱患，故反應(yīng)溫度應(yīng)低于78.3℃。異丙醇的沸點(diǎn)為82.5℃，當(dāng)反應(yīng)溫度高于78.3℃而低于82.5℃時(shí)，異丙醇不會(huì)揮發(fā)出來(lái)，故反應(yīng)溫度可高于78.3℃。在一定溫度范圍內(nèi)，由于產(chǎn)物的得率、取代度會(huì)隨著溫度的升高而提高，因此反應(yīng)溫度越接近82.5℃，產(chǎn)物的得率、取代度就會(huì)越高，故采用異丙醇比采用乙醇的效果好。另一方面，由于反應(yīng)物是在異丙醇作為溶劑下進(jìn)行反應(yīng)的，為了方便溶劑的蒸餾回用，采用異丙醇作為置換脫水劑。

2.2反應(yīng)物摩爾比對(duì)抑菌效果的影響

 圖1和圖2分別為反應(yīng)物摩爾比[n（殼聚糖）：n(ETA)]對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌率的影響。從圖1、圖2可以看出，殼聚糖季銨鹽對(duì)大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的抑菌率隨反應(yīng)物摩爾比的增加而增加，而當(dāng)ETA用量達(dá)到殼聚糖的6倍以后，抑菌率增加不再明顯。這是由于殼聚糖季銨鹽的抑菌效果與殼聚糖季銨鹽的取代度有關(guān)，取代度越高，單位質(zhì)量的殼聚糖季銨鹽含有越多的正電荷，可能就越容易吸附在帶負(fù)電的細(xì)胞壁上，破壞細(xì)胞的正常生理活動(dòng)，使細(xì)菌死亡。表3為反應(yīng)物摩爾比對(duì)殼聚糖季銨鹽取代度的影響。由表3可知，殼聚糖季銨鹽的取代度隨反應(yīng)物摩爾比的增加而增加，這是因?yàn)闅ぞ厶遣蝗苡诋惐�醇，殼聚糖與ETA接觸幾率隨ETA用量的增加而增加，有利于親核反應(yīng)；但當(dāng)ETA用量達(dá)到殼聚糖的6倍時(shí)，殼聚糖上可供取代的基團(tuán)有限，且隨著反應(yīng)的進(jìn)行，空間位阻也會(huì)增加，取代反應(yīng)不易進(jìn)行，故繼續(xù)增加ETA用量，產(chǎn)物的取代度變化不大；另外，從表3中也可看出采用有機(jī)溶劑對(duì)殼聚糖進(jìn)行置換脫水，與空白樣相比取代度提高的相當(dāng)明顯，其中采用異丙醇對(duì)殼聚糖置換脫水，取代度提高最明顯。當(dāng)n（殼聚糖）：n(ETA)=1:6，且采用異丙醇對(duì)殼聚糖脫水時(shí)，從實(shí)際抑菌效果及生產(chǎn)成本考慮，可使企業(yè)獲得最大效益。

 另外，從圖1、圖2也可以發(fā)現(xiàn)，殼聚糖季銨鹽對(duì)兩種菌的抑菌效果隨濃度的增加而提高，但殼聚糖季銨鹽在各濃度下對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果要比對(duì)大腸桿菌的效果差，這主要是由于金黃色葡萄球菌是典型的革蘭氏陽(yáng)性菌，細(xì)胞壁較厚，約20~ 80 nm，肽聚糖含量豐富，有15 N50層。大腸桿菌是革蘭氏陰性菌，細(xì)胞壁厚度約10 nm，僅2~3層肽聚糖。帶正電的殼聚糖季銨鹽吸附在帶負(fù)電的細(xì)胞壁上，而細(xì)胞壁越薄，殼聚糖季銨鹽可能越易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，其生長(zhǎng)所需的平衡也越易遭到破壞，最后細(xì)胞可能會(huì)發(fā)生凹陷而死亡。因此殼聚糖季銨鹽對(duì)大腸桿菌的抑菌效果要比對(duì)金黃色葡萄糖球菌的好。

2.3殼聚糖季銨鹽的抑菌機(jī)理分析

 利用殼聚糖季銨鹽對(duì)白水中常見(jiàn)的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行處理，在SEM下進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖3、圖4所示。從圖3可以看出大腸桿菌呈桿狀，在未經(jīng)處理時(shí)，細(xì)胞表面光滑，而經(jīng)處理后，細(xì)胞表面發(fā)生凹陷。從圖4可以看出金黃色葡萄球菌呈球狀，未經(jīng)處理時(shí)，細(xì)胞表面光滑，而經(jīng)處理后細(xì)胞也發(fā)生凹陷。這主要是由于殼聚糖季銨鹽帶正電，吸

附帶負(fù)電的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁，在菌體細(xì)胞壁表面形成一層膜，菌體細(xì)胞膜的通透性會(huì)發(fā)生改變，使細(xì)胞膜喪失選擇透過(guò)性。這樣細(xì)胞內(nèi)部一些重要的離子如鈉離子鉀離子會(huì)泄漏出去，離子的流失會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，這破壞了原有的平衡，細(xì)胞發(fā)生破裂，使得細(xì)胞的原生質(zhì)如蛋白質(zhì)、水等滲出，菌體表面發(fā)生凹陷，最后死亡。另外，小分子的殼聚糖季銨鹽可能會(huì)通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)，吸附帶有陰離子的細(xì)胞質(zhì)，并與其發(fā)生絮凝作用擾亂細(xì)胞正常生理活動(dòng)，細(xì)胞發(fā)生破裂，菌體凹陷而死去。

2.4殼聚糖季銨鹽與常見(jiàn)抑菌劑的對(duì)比

 將殼聚糖季銨鹽與造紙行業(yè)常用的異噻唑啉酮、吡啶硫酮鋅、十六烷基三甲基氯化銨3種抑菌劑進(jìn)行抑菌性能對(duì)比，結(jié)果如圖5和圖6所示。通過(guò)對(duì)比分析可知，殼聚糖季銨鹽的抑菌效果與異噻唑啉酮的抑菌效果相差較大，但其與吡啶硫酮鋅相比，具有很大的優(yōu)勢(shì)。從圖5、圖6也可以發(fā)現(xiàn)，隨著抑菌劑濃度的增加，殼聚糖季銨鹽對(duì)兩種菌的抑菌曲線與十六烷基三甲基氯化銨的抑菌曲線分別在一定濃度出現(xiàn)交點(diǎn)，且兩條曲線間的距離相差不大，抑菌率最大差值不到5%，可以認(rèn)為兩種抑菌劑的抑菌效果基本相當(dāng)。但是，十六烷基三甲基氯化銨對(duì)水生生物有極高毒性，長(zhǎng)期使用會(huì)對(duì)水體環(huán)境產(chǎn)生不良影響，故不適宜用于處理造紙白水。而殼聚糖季銨鹽是一種環(huán)保抑菌劑，其對(duì)微生物有良好的抑菌效果，可用于處理造紙白水中的微生物。

2.5殼聚糖季銨鹽的廣譜性分析

 造紙白水中常見(jiàn)的微生物除大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以外，主要還有黑曲霉菌、綠膿桿菌、枯草桿菌等，因此檢測(cè)殼聚糖季銨鹽對(duì)黑曲霉菌、綠膿桿菌、枯草桿菌的抑菌效果結(jié)果見(jiàn)圖7。從圖7可知，殼聚糖季銨鹽對(duì)黑曲霉菌、枯草桿菌、綠膿桿菌均有顯著的抑菌效果，且抑菌效果隨濃度的增加而提高。再結(jié)合圖5、圖6可知?dú)ぞ厶羌句@鹽對(duì)白水中常見(jiàn)的5種微生物均有顯著的抑菌效果，可以認(rèn)為殼聚糖季銨鹽是一種廣譜抑菌劑。

2.6殼聚糖季銨鹽與異噻唑啉酮復(fù)配的抑菌效果

 異噻唑啉酮是造紙企業(yè)處理白水微生物常用的抑菌劑，異噻唑啉酮抑菌是依靠雜環(huán)上的S-N鍵活性部位與蛋白質(zhì)的半胱氨酸上的巰基形成二硫鍵，從而使蛋白質(zhì)失活，達(dá)到抑菌的目的。而殼聚糖季銨鹽的抑菌作用主要是改變細(xì)胞膜的通透性，最后使細(xì)胞發(fā)生凹陷達(dá)到抑菌的目的。由于兩種抑菌劑的抑菌機(jī)理不同，實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行復(fù)配，以期在抑菌效果上相互補(bǔ)充。

 把殼聚糖季銨鹽與異噻唑啉酮進(jìn)行復(fù)配，然后處理大腸桿菌與金黃色葡萄球菌，抑菌效果如表4、表5所示。從表4和表5可知，在相同用量時(shí)，兩種抑菌劑復(fù)配后的抑菌效果明顯好于異噻唑啉酮單一使用時(shí)的效果。當(dāng)抑菌劑濃度為100、250、500 mg/L時(shí)，隨著殼聚糖季銨鹽用量的增加，復(fù)配抑菌劑對(duì)兩種菌的抑菌效果提高，但是當(dāng)殼聚糖季銨鹽用量大于20%時(shí)，抑菌率下降，因此從實(shí)際抑菌效果考慮可選取在異噻唑啉酮中加入用量20%殼聚糖季銨鹽。另外，在工業(yè)上如果長(zhǎng)期使用單一抑菌劑也會(huì)使微生物產(chǎn)生抗藥性，將兩種抑菌劑復(fù)配使用，能有效避免這一問(wèn)題。

 因此，把殼聚糖季銨鹽與異噻唑啉酮進(jìn)行復(fù)配，不僅能提高抑菌效果，同時(shí)也能有效緩解白水微生物對(duì)單一抑菌劑產(chǎn)生耐藥性的問(wèn)題。

3結(jié)論

 (1)采用異丙醇和乙醇對(duì)殼聚糖置換脫水都能顯著提高殼聚糖季銨鹽得率和取代度，但使用異丙醇時(shí)的取代度和得率更高，得率能達(dá)到60. 3%、取代度達(dá)到0. 86，與空白樣相比得率提高14.3個(gè)百分點(diǎn)、取代度提高0. 24。

 (2)殼聚糖季銨鹽的抑菌機(jī)理是帶正電的殼聚糖季銨鹽吸附在帶負(fù)電的細(xì)胞壁表面，改變細(xì)胞膜的通透性，同時(shí)相對(duì)分子質(zhì)量小的殼聚糖季銨鹽也會(huì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，破壞細(xì)胞正常生長(zhǎng)所需的各種平衡，細(xì)胞發(fā)生凹陷，菌體死亡。

 (3)不同反應(yīng)物摩爾比生產(chǎn)的殼聚糖季銨鹽產(chǎn)品對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均有抑菌效果。從實(shí)際抑菌效果及生產(chǎn)成本考慮，最佳n（殼聚糖）：n(ETA)= 1:6，此條件下生產(chǎn)的殼聚糖季銨鹽對(duì)黑曲霉菌、綠膿桿菌、枯草桿菌也都具有很好的抑菌效果，是一種廣譜抑菌劑，可用于處理造紙白水中的微生物；其抑菌效果比異噻唑啉酮的低，但比吡啶硫酮鋅的高，

與十六烷基三甲基氯化銨的效果相當(dāng)。

 (4)殼聚糖季銨鹽與異噻唑啉酮復(fù)配后，能提高處理白水微生物的效果，從實(shí)際抑菌效果考慮，在異噻唑啉酮中加入用量20%殼聚糖季銨鹽最好，同時(shí)也能有效緩解白水微生物對(duì)單一抑菌劑產(chǎn)生耐藥性的問(wèn)題。