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 周超，任佳麗*，周玉庭，黃江，馬麗娜

 中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（長沙410004）

摘  要  研究了基于頂空-固相微萃�。瘹赓|(zhì)聯(lián)用(Headspace-solid Phase Microextraction/Gas Chromatography-massSpectrometry，HS-SPME/GC-MS)分析大腸桿菌污染鮮牛奶的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的方法。選擇75 μm碳分子篩／聚二甲基硅氧烷(Carbon/PolydimethyLsiloxane, CAR/PDMS)固相微萃取纖維頭；Rtx-5色譜柱；升溫程序：30C保持12min,4℃/min升到102℃，2.5℃/nun升到170℃, 10℃/min升到220℃。并基于以上方法檢測到大腸桿菌污染鮮牛奶的19種主要揮發(fā)性成分（胺、酸、酮、醚、醛和烷烴類），空白鮮牛奶的17種主要揮發(fā)性成分（胺、酸、酮、醇、醛、烷烴），經(jīng)綜合分析得到大腸桿菌污染鮮奶的典型揮發(fā)性成分：2-羥基-丙酰胺、丙氨酰基-丙酰胺、3，6-二甲基-2, 5-哌嗪雙酮、卡西酮、辛醛；該方法的建立可為基于揮發(fā)性代謝產(chǎn)物鑒別食源性致病菌污染提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞頇空-固相微萃�。瘹赓|(zhì)聯(lián)用；大腸桿菌；鮮牛奶；揮發(fā)性成分

 牛乳營養(yǎng)豐富，含水量高，pH近中性，極易被致病微生物污染而引發(fā)食源性疾病，故快速檢測和鑒定牛乳中的致病微生物污染對于保證牛乳品質(zhì)和飲用安全至關(guān)重要。正常牛乳具有特殊的芳香味，而微生物污染導(dǎo)致的腐敗則會使牛乳因蛋白質(zhì)、脂肪等分解產(chǎn)生異味。所以，可以根據(jù)牛乳揮發(fā)性成分的變化鑒別致病微生物對牛乳的污染。大腸桿菌是牛奶在擠奶、運(yùn)輸和儲藏過程中極易污染的一種致病菌，可引起腹痛、腹瀉等食源性疾病，嚴(yán)重者甚至危及生命。因此，以大腸桿菌污染鮮奶為對象進(jìn)行研究，對預(yù)防由此導(dǎo)致的食物中毒具有重要意義。

 氣相色質(zhì)譜聯(lián)用儀( GC-MS)可對復(fù)雜的有機(jī)化合物進(jìn)行高效的定性、定量分析，試驗(yàn)結(jié)合集萃取、濃縮、解吸、進(jìn)樣為一體的固相微萃取( SPME)樣品前處理技術(shù)對大腸桿菌污染鮮奶的揮發(fā)性成分進(jìn)行研究。由于每種微生物都有其特有的分解代謝途徑，通過分析大腸桿菌的特征代謝產(chǎn)物組，可為開發(fā)基于揮發(fā)性代謝產(chǎn)物早期快速鑒別大腸桿菌污染牛乳的新技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。

1試驗(yàn)部分

1.1材料

 鮮牛奶：市售全脂巴氏殺菌乳(脂肪含量3.1%)，保質(zhì)期內(nèi)；菌種：大腸桿菌ATCC 25922；

胰酪胨大豆肉湯( Trypticase Soy Broth，TSB)：30 g于1000 m L蒸餾水；胰蛋白胨大豆瓊脂(Tryptose SoyaAgar，TSA)：38 g于1 000 m L蒸餾水，煮沸溶解；乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基：稱取3.5 g煮沸溶解于100 m L蒸餾水；伊紅美藍(lán)瓊脂( Eosin Methylene Blue Agar，EMB)：稱取37.5 g煮沸溶解于1000 m L蒸餾水；營養(yǎng)瓊脂：牛肉膏3g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 m L，各藥品于蒸餾水中煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH至7.0～7.2，過濾分裝并加塞包扎；以上培養(yǎng)基均121℃20 min高壓滅菌備用。

1.2儀器與設(shè)備

 SPME手柄及75 μm CAR/PDMS（碳分子篩／聚二甲基硅氧烷）萃取頭：美國，西格瑪奧德里奇；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：GC-MS Clarus 600，Perkins Elmer；SW-CJ-2F型雙面凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZNCL智能恒溫磁力攪拌器：河南愛博特科技發(fā)展有限公司；電子分析天平；高壓滅菌鍋；萬用電

爐；SK-1快速混勻器；冰箱：2℃~5℃。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1鮮牛奶污染情況確證

  用10 m L無菌移液管移取10 m L鮮牛奶，轉(zhuǎn)移至100 m L無菌乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基，振蕩混勻；然后分裝到有倒立發(fā)酵管的20 mm×150 mm試管中，每管10m L，3個(gè)平行管，以上操作在無菌條件下進(jìn)行。

 把試管放置到恒溫培養(yǎng)箱36℃±l℃培養(yǎng)24±2h；選擇小倒管內(nèi)有氣泡的試管，三區(qū)劃線于伊紅美藍(lán)瓊脂平板，每管3個(gè)平板，于恒溫培養(yǎng)箱36℃±1℃培養(yǎng)18～24 h后觀察平板上的菌落特征。

1.3.2檢樣的制備

 接種：無菌移液管移取9 m L鮮牛奶加1 m L菌液做10倍遞增梯度稀釋，每遞增稀釋一次換一根1 m L無菌吸管。制備1.5×108 CFU/m L大腸桿菌菌液，經(jīng)3次梯度稀釋，得到含大腸桿菌1.5×105 CFU/m L的鮮牛奶（大腸桿菌污染鮮牛奶）。

 無菌移液管移取3 m L大腸桿菌污染鮮牛奶于頂空瓶中，換一根移液管移取3 m L不含菌的鮮牛奶于頂空瓶中作空白對照，每個(gè)頂空瓶中加一粒磁力攪拌子，擰緊帶硅膠墊片的蓋子。以上操作均在無菌條件下進(jìn)行。

 培養(yǎng)：空白對照頂空瓶置于4℃冰箱，大腸桿菌污染鮮牛奶頂空瓶置于恒溫箱36℃±1℃培養(yǎng)12 h后轉(zhuǎn)移到4℃冰箱，抑制大腸桿菌繼續(xù)生長，然后與空白一起進(jìn)行GC-MS測定。

1.3.3  SPME的老化及萃取

 SPME萃取頭的老化：試驗(yàn)用CARJPDMS萃取頭，老化條件為300℃1～2 h，再把GC-MS進(jìn)樣口溫度設(shè)置為300℃進(jìn)行老化。

 萃�。合扔弥悄芎銣卮帕�攪拌器對頂空瓶進(jìn)行恒溫水浴加熱和磁力攪拌（較大轉(zhuǎn)速），頂空固相微萃取(Head Space Solid Phase Micro-extraction,HS-SPME)時(shí)條件相同，條件如表1所示。

1.3.4  SPME/GC-MS檢測

 進(jìn)樣：把SPME緩慢插入GC-MS進(jìn)樣口進(jìn)樣，解吸10 min。

 GC-MS檢測條件：色譜條件為進(jìn)樣口250℃，10：1的分流；氦氣為載氣，流速1.0 m L/min；色譜柱Rtx-5（0.25 mm ID×30 m×0.25μm d f），升溫程序：30℃保持12 min，4℃/min升到102℃，2.5℃/min升到170℃，10℃/min升到220℃，保持8 min；整個(gè)升溫程序70.2 min。質(zhì)譜條件為電子轟擊(EI)離子源，電離電壓70 e V，離子源230℃，傳輸線230℃，掃描質(zhì)量范圍（m/z）33～650 amu。

2結(jié)果與討論

 采用頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用( HS-SPME/GC-MS)檢測得到的大腸桿菌污染鮮牛奶（大腸桿菌初始濃度1.5×105 CFU/m L，36℃±1℃培養(yǎng)12 h）和空白對照的GC-MS圖譜如圖1所示。

 圖1和2分別是大腸桿菌污染鮮牛奶和空白各自的GC-MS譜圖，由這兩個(gè)圖可以看出，大腸桿菌污染鮮牛奶譜圖中的峰高度較空白譜圖中的峰高度矮一些，且有一些新的峰出現(xiàn)，說明大腸桿菌污染鮮牛奶中有原物質(zhì)消耗和新物質(zhì)生成。

 各組分經(jīng)Turbo MassTM NIST MS Search 2.0軟件處理，根據(jù)質(zhì)譜的匹配因子自動作出鑒定（NET>80的結(jié)果予以報(bào)道），結(jié)果參見表2。

 由表2可知，大腸桿菌污染鮮牛奶和空白對照鮮牛奶共有的揮發(fā)性物質(zhì)有壬醛、辛酸、5，7-二甲基一十一烷、癸酸、十六烷、十九烷、3，8-二甲基一十一烷、2，6-二（1，1-二甲基乙基）-2, 5-環(huán)己二烯一1，4-酮、二十烷、二十七烷。丙氨�；�-丙氨酸、2-氰乙酰胺、3，6-二甲基-2，5-哌嗪雙酮、2-羥基-丙酰胺、乙二酰胺、卡西酮、苯甲基，異戊基-乙醚、辛醛、2-十二酮是大腸桿菌污染鮮牛奶特有的揮發(fā)性物質(zhì)；甲基丙烯酰胺、5-庚烯-2-酮、苯、苯乙酰胺、3-癸炔-2-醇、2-甲基一十一醛、萘是鮮牛奶特有的揮發(fā)性物質(zhì)。

  鮮牛奶含有4.5%～5%的乳糖，大腸桿菌在鮮奶中以乳糖作為生長所需的唯一碳源，代謝為丙酮酸。鮮牛奶中蛋白質(zhì)含量在3.7%左右，提供大腸桿菌生長所需的氮源。大腸桿菌能分泌胞外蛋白酶，把蛋白質(zhì)分解成氨基酸。氨基酸在脫羧酶的催化下脫去羧基生成胺和二氧化碳。氨基酸發(fā)生脫氨基作用會生成酮酸和氨，由糖酵解作用生成的丙酮酸上羧基若與氨發(fā)生酸堿中和反應(yīng)，羧羥基被氨基取代則生成酰胺鍵的結(jié)構(gòu)；推測該大腸桿菌可能會產(chǎn)生羰基還原酶，將丙酮酸連有甲基的羰基還原成羥基。經(jīng)過以上兩種變化后丙酮酸就轉(zhuǎn)化成了2-羥基-丙酰胺。大腸桿菌發(fā)酵時(shí)會代謝葡萄糖產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物——乙酸。由此可知大腸桿菌污染鮮奶的pH會隨大腸桿菌分解葡萄糖產(chǎn)生乙酸的累積而降低。2-羥基-丙酰胺的羥基在酸性條件下可能會發(fā)生質(zhì)子化，然后與氨基發(fā)生脫水反應(yīng)。所以，兩分子2-羥基-丙酰胺可能會脫一分子水生成鏈狀的丙氨�；�-丙酰胺，也可能會脫兩分子水生成環(huán)狀的3，6-二甲基-2，5-哌嗪雙酮，結(jié)構(gòu)式如圖3所示。

 大腸桿菌分泌的胞外蛋白酶把鮮牛奶中的蛋白質(zhì)分解成氨基酸，又知許多氨基酸是一碳單位來源，甲基就是一種-碳單位。所以，推測大腸桿菌污染鮮牛奶中檢測到的卡西酮有可能是鮮牛奶中本來存在的苯乙酰胺，在大腸桿菌含有的甲基化酶的催化下利用氨基酸提供的一碳單位——甲基，使苯乙酰胺的碳氮單鍵斷裂的同時(shí)發(fā)生甲基化形成，過程如圖4所示。

 由表2知，鮮牛奶中檢測到辛酸，大腸桿菌污染的鮮牛奶中檢測到辛酸和辛醛。推測可能是辛酸的羧基與氨基酸脫氨基作用產(chǎn)生的氨發(fā)生酸堿中和，從而被酰胺化，之后又在大腸桿菌產(chǎn)生的還原酶的催化下被還原變成醛基，得到辛醛，如圖5所示。

  根據(jù)大腸桿菌在鮮牛奶中的分解代謝和物質(zhì)變化推測可知，2-羥基-丙酰胺、丙氨�；�-丙酰胺、3，6-二甲基-2，5-哌嗪雙酮、卡西酮和辛醛是大腸桿菌污染鮮牛奶中典型揮發(fā)性成分。

3結(jié)論

 試驗(yàn)建立了HS-SPME/GC-MS檢測大腸桿菌污染鮮牛奶揮發(fā)性成分的方法。結(jié)合Turbo MassTM NISTMS Search 2.0軟件分析GC-MS總離子流圖，檢測到大腸桿菌污染鮮牛奶的19種揮發(fā)性成分（胺、酸、酮、醚、醛和烷烴類），空白對照鮮牛奶的17種揮發(fā)性成分（胺、酸、酮、醇、醛和烷烴類）。依據(jù)大腸桿菌在鮮奶中的分解代謝和物質(zhì)轉(zhuǎn)化，推測出2-羥基-丙酰胺、丙氨酰基-丙酰胺、3， 6-二甲基-2，5-哌嗪雙酮、卡西酮、辛醛是大腸桿菌污染鮮奶的典型揮發(fā)性成分；可作為大腸桿菌污染鮮奶的典型標(biāo)志物，也為基于揮發(fā)性代謝產(chǎn)物快速鑒別大腸桿菌污染鮮奶提供理論依據(jù)。