HPLC法測定不同選育豬肉中肌苷酸的含量
王衛(wèi)1，李翔1*，龔建軍2，劉詩瑤1，鄭自立1，尹超群1
1．成都大學肉類加工四川省重點實驗室（成都610106）；2．四川省畜牧科學研究院（成都610066）
摘要 以高效液相色譜法測定選育品種豬肉中肌苷酸的含量，以期建立一種評價選育品種豬肉風味前體物質的評定方法。采用DIONEX-HPLC儀，Alltech Apollo C18 (4.6 mm×250 mm，Ф5μm)色譜柱，甲醇-磷酸三乙醇胺(5：95)為流動相，柱溫25 0C，檢測波長254 nm,方法的檢測限分別為0.004 μg/m L，方法精密度RSD值在4.65%~0.55%，平均回收率101.24%，線性范圍0.4～20μg/m L。測定了培育的CH和S05品種豬肉中的肌苷酸的含量，CH豬樣肌苷酸含量為1.642 g/kg，S05豬肉中肌苷酸含量為1.428 g/kg。優(yōu)選品種CH豬肉中肌苷酸含量高于的對照品種豬S05的肌苷酸含量。通過對肌苷酸的含量對比分析，建立豬肉中鮮味物質的測定方法，為不同風味豬的選育建立評價體系。
關鍵詞選育；豬肉；風味物質：肌苷酸；高效液相色譜
肉及肉制品的營養(yǎng)、衛(wèi)生和風味是我國肉類產業(yè)的三大研究方向，也是畜牧業(yè)生產肩負的歷史重任。肉品風味包括滋味和香味，滋味來源于肉中的滋味呈味物質，主要是無機鹽、游離氨基酸、小肽和核酸代謝產物如肌苷酸、核糖等非揮發(fā)性水溶性物質。肌苷酸( IMP)是畜禽肉中重要的鮮味物質，其增加鮮味的能力比谷氨酸鈉( MSG)強幾十倍，肌苷酸還是各
種調味食品的營養(yǎng)助鮮劑，其含量作為衡量新鮮度的指標，國際上已將其作為肉質鮮味的重要指標。測定肉類食品中IMP的含量對研究肉類食品風味及呈味物質之間的相互關系有著重要的意義。有報道采用紫外分光光度法檢測不同品種豬肉中肌苷酸含量差異顯著，另有研究顯示保藏條件會影響蝦肉中肌苷酸積累，而在冷藏條件下蒙山雞肉中肌苷酸分解速度更慢，作為肉品質中重要指標的肌苷酸在各個選育品種的變化規(guī)律及與其它肉品質生化指標的相關性卻未進行過系統(tǒng)性研究，采用HPLC法檢測肌苷酸為不同選育品種豬肉風味建立穩(wěn)定的評價指標的研究還不多見。
以選育的S05和CH品種豬為研究對象，通過建立HPLC法測定選育豬肉中肌苷酸含量，評價選育品種豬肉風味物質質量指標的評定方法，旨在探索地方豬種優(yōu)良肉質特性的形成和調控機制，為地方豬種資源的開發(fā)利用和優(yōu)質豬肉的生產以及豬肉制品冷鏈物流中肉類品質控制提供參考依據。
1 材料與方法
1.1原料與儀器、試劑
S05豬肉和CH豬肉由四川省畜牧科學研究院豬育種基地提供，S05系是該院培育的川藏黑豬配套系的一個專門化父系、由巴克夏豬直接選育而成。CH是配套系中的一個雜優(yōu)組合、含巴克夏、藏豬與梅山豬血緣。飼養(yǎng)月齡6個月，體重90 kg，均取自背最長肌，-18℃儲藏。
戴安P680-DAD高效液相色譜儀；PDA光二級管陣列檢測器；色譜柱Alltech Apollo C18( 4.6 mm×250mm，Ф5μm)。
色譜級甲醇，其余試劑均為分析純。肌苷酸對照品購于四川省食品與藥品鑒定所。
1.2標準液配制
準確稱量20 mg肌苷酸標準物質至50 m L容量瓶，用50%甲醇溶液溶解并定容，為母液，于4℃冰箱中保存。吸取母液1.00 m L至10 m L容量瓶中，用50%甲醇溶液定容，配成質量濃度為40μg/m L的標準儲備液，于4℃冰箱中保存。
1.3樣品制備
豬肉樣品洗凈切碎后用絞肉機絞碎至肉糜狀。精確稱取10.000 0 g，置于100 m L離心管，加入30 m L 5%預冷高氯酸，高速均質后，以4 000 r/min的轉速離心5min，取上清液轉入100 m L燒杯，殘渣用30 m L 5%高氯酸振蕩5 min，再以4 000 r/min離心5 min，合并上清液，用KOH溶液調pH至6.5，過濾至100 m L容量瓶，超純水定容搖勻，做樣品儲備液。
1.4色譜條件
色譜柱，Alltech Apollo C18( 4.6 mm×250 mm，Ф5μm)；流動相：A為甲醇溶液，B為磷酸三乙醇胺溶液（磷酸3.5 m L和三乙醇胺7 m L于100 m L容量瓶中，磷酸調pH至5.0，超純水定容至刻度，搖勻），A：B=5：95，柱溫25℃，流速0.8 m L/min，進樣量10μL，檢測波長248 nm。
1.5線性范圍考察
分別精密移取1.2中標準溶液分別吸取標準儲備液各0.1，0.50，1.00，2.00和5.00 m L至10 m L容量瓶，用50%甲醇溶液分別稀釋定容至10 m L，分別配成0.4，2.00，4.0，8和20μg/m L的溶液，在1.4色譜條件下分別進樣3針。以標準品峰面積(Y)為縱坐標，以標準品溶液質量濃度（X，μg/m L）為橫坐標，繪制標準曲線，進行回歸分析，求其回歸方程和相關系數R。
1.6精密度試驗
分別取質量濃度為0.4，4和20μg/m L的標準品溶液，在1.4色譜條件下分別連續(xù)進樣5針，測定肌苷酸標準品的日間精密度。
1.7定量限和檢測限試驗
將質量濃度為0.4μg/m L的標準品溶液依次稀釋，分別進樣3針，計算峰面積的平均值，以S/N的10倍和3倍確定其定量限和檢測限。
1.8重現性試驗
精密稱取S05豬肉肉糜6份，每份10.000 0 g，按1.3條件進行樣品溶液制備，按照1.4色譜條件進行HPLC測定，計算含量，確定重現性。
1.9穩(wěn)定性試驗
精密稱取S05豬肉肉糜3份，按照1.3條件制備樣品溶液，室溫下放置1，2，4，8和12 h，按照1.4條件下色譜條件測定其峰面積，考察穩(wěn)定性。
1.10回收率試驗
稱取5.000 0 g S05豬肉肉糜3份，分別加入質量濃度為0.24 mg/m L肌苷酸標準溶液2.5 m L，按1.3制備樣品，按1.4色譜條件進行HPLC分析。依據加標前后樣品中肌苷酸濃度與加標量，計算肌苷酸的回收率。
1.11肌苷酸樣品測定
取10.000 0 g S05和CH豬肉肉糜各三份，按照1.3的方法制備，按1.4中的色譜條件進行分析，通過得出的色譜峰面積計算出豬肉中肌苷酸的含量，公式為：
2結果與分析
2.1色譜條件的選擇2.1.1波長的選擇
將配制的標準溶液通過紫外分光光度計掃描，得到最佳波長為248 nm。
2.1.2色譜柱的選擇
用色譜柱AGILENT ZOBAX-NH2( 4.6 mm×250mm，Ф5μm)和Alltech Apollo C18進行試驗，各色譜柱對分離效果影響不大，因此選用Alltech Apollo C18。
2.1.3流動相的選擇
考察甲醇-磷酸三乙醇胺體系，甲醇-甲酸銨體系，樣品分離度和基線穩(wěn)定性效果較好的為甲醇-磷酸三乙醇胺體系，當流速為0.8 m L/min時，考察甲醇一磷酸三乙醇胺體系的不同比例，當甲醇-磷酸三乙醇胺體系為5：95時，分離度大于1.5，保留時間在6 min左右，因此確定流動相為甲醇-磷酸三乙醇胺(5：95)。
2.1.4柱溫的選擇
考察柱溫在20℃，25℃和30℃下，肌苷酸分離效果25℃時最佳。綜合優(yōu)選確定色譜條件為：色譜柱Alltech Apollo C18（4.6 mm×250 mm，Ф5μm）；流動相：甲醇-磷酸三乙醇胺(5：95)；流速0.8 m L/mm，柱溫25℃，檢測波長248 nm；進樣量10 VL。檢測結果見圖1。
2.2檢測方法的建立
2.2.1標準曲線及線性范圍
在最佳色譜條件下建立的標準曲線方程為Y=0.380 4X-0.128 7,r=0.999 79，在0.4～20 μg/m L質量濃度范圍內，肌苷酸有良好的線性關系。
2.2.2精密度試驗
在高中低三個濃度上測定了方法的精密度，試驗結果表明該方法在高中低三個濃度范圍內具有較好的精密度，RSD值在4.65%～0.55%，滿足測定要求。結果如表1所示。
2.2.3方法檢測限試驗
在最佳色譜條件下測定的肌苷酸標品溶液峰面積，當其質量濃度為0.02 μg/m L時，SN：約為10倍，當其濃度為0.004 μg/m L時，S/N約為3倍。因此，該分析方法檢測限為0.004μg/m L。
2.2.4重現性試驗
6份S05豬肉肉糜樣品的含量分別為1.415，1.425, 1.400, 1.455，1.435和1.420 g/kg。平均值為1.425 g/kg，RSD為1.31%（n=6）。表明該方法具有良好的重現性。
2.2.5穩(wěn)定性試驗
3份S05豬肉肉糜樣品在分別放置后測定的含量平均值結果見表2，試驗表明，樣品溶液在8h內其RSD為1.95%(，n=3)，穩(wěn)定性良好。因此樣品制備完畢后應該在8 h內完成測定。
2.2.6加樣回收率試驗
以S05豬肉肉糜測為對象，在最佳色譜條件下測定的加樣回收率結果見表3，平均回收率為101.24%，表明該方法具有較好的準確性。
2.3兩種選育的豬肉樣品中肌苷酸的含量測定
在最佳色譜條件下對兩種育種的豬肉進行測定，測定結果見表4。經計算品種CH豬肉中的肌苷酸含量為1.642 g/kg，品種S05豬肉中的肌苷酸含1.428 g/kg。
3結論
探討為現代選育品種豬肉風味評價指標肌苷酸含量測定，建立精確度和準確性更高的液相色譜法。在總結前人研究的基礎上，通過對HPLC法各項分析條件的改進，采用戴安P680-DAD高效液相色譜儀，PDA光二級管陣列檢測器，色譜柱Alltech Apollo C18（4.6 mm×250 mm，Ф5μm），甲醇-磷酸三乙醇胺(5：95)為流動相，能很好地將肌苷酸分離出來，
且峰型較好，兩個豬肉樣品的出峰時間分別是5.53和5.55 min，樣品中肌苷酸與標準品保留時間基本一致，在0.4～20 μg/m L質量濃度范圍內，肌苷酸有良好的線性關系，平均加標回收率為101.24%，有良好的重現性和穩(wěn)定性。該法在高中低三個濃度范圍內具有較好的精密度，RSD值在4.65%～0.55%。以方法檢測出選育品種豬肉樣品中，CH豬樣肌苷酸含量為1.642g/kg，S05豬肉中肌苷酸含量為1.428 g/kg。由此可見培育的豬種CH肌苷酸含量高于S05豬種，這與我國地方品種豬肉品質優(yōu)良、風味濃郁肌肉細嫩多汁相一致，豬肉中肌苷酸含量存在品種差異，這表明肌苷酸含量受遺傳因素影響也就是說可以通過系統(tǒng)選育提高肌苷酸含量培育優(yōu)質配套系，為探索地方豬種資源的開發(fā)利用和優(yōu)質豬肉的生產及肉類品質控制提供科學依據。
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