食品中淀粉測定之酶水解法的改進
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湯璐1，郭嘉2，熊郃3．王維嘉3，薛永萍1*
1．武漢工程大學(xué)郵電與信息工程學(xué)院化工與材料學(xué)部（武漢430073）；2．武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院（武漢430073）；3．通標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司武漢分公司農(nóng)產(chǎn)食品部理化實驗室（武漢430064）
摘要根據(jù)GB/T 5009.9-2008“食品中淀粉的測定”第一法酶水解法中的淀粉含量測定方法，選用淀粉試劑做對比參照試驗對該方法加以改進以確保測定值的準(zhǔn)確度。試驗結(jié)果表明，該改進措施不僅可以核實測定操作過程的規(guī)范性，還可以減小主客觀因素導(dǎo)致的偏差，從而對試樣測定結(jié)果進行校正，使其更準(zhǔn)確。
關(guān)鍵詞 淀粉；酶水解法；測定；對比參照試驗
淀粉是植物的碳水化合物儲藏體，是人類所需碳水化合物的主要來源。食品理化檢測中，淀粉含量能反映該食品的糖分、熱量和營養(yǎng)價值等，是經(jīng)常需要檢測的指標(biāo)之一。準(zhǔn)確地了解食品中的淀粉含量能正確指導(dǎo)不同需求的人群的日常飲食。目前，食品中淀粉的測定方法主要有酶水解法和酸水解法。其中，酶水解法是應(yīng)用比較廣泛的方法，其原理是將試樣去除脂肪和可溶性糖類后，以淀粉酶將淀粉水解成小分子糖，再用鹽酸將其水解成單糖，然后按葡萄糖測定，最后折算成淀粉含量。
目前，GB/T 5009.9-2008“食品中淀粉的測定第一法酶水解法”中規(guī)定了食品中淀粉測定的方法。該國標(biāo)方法規(guī)定了試劑空白試驗，以消除測定用試劑中的淀粉、糖分等的干擾。在測定過程中，水解是否完全，洗滌樣品是否流失過多，滴定終點判斷是否準(zhǔn)確，人為操作是否規(guī)范，這些影響試驗結(jié)果的因素就需要核實、校正。通過多組平行試驗可以提高試驗結(jié)果的精密度，但如何保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確度呢？可以通過測定已知淀粉含量的樣品（如淀粉試劑）做對照試驗，對測試試樣結(jié)果進行核實、校對，用于指導(dǎo)測定工作，可以較好地保證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。所以在食品的淀粉測定過程中，不僅要按同一方法做空白試驗，并且還要按同一方法用淀粉試劑（已知淀粉含量且含量穩(wěn)定）做百分比含量試驗，最后將試樣測定數(shù)據(jù)除以該百分比含量進行校正，即可減少人為操作差異、水解完全程度等諸多主客觀因素導(dǎo)致的誤差，其試驗結(jié)果將更為準(zhǔn)確、可信。
1 材料與方法
1.1材料與試劑
食用蒸肉粉樣品，市售。
碘、碘化鉀、高峰氏淀粉酶(酶活力≥1.6 U/mg)、無水乙醇、乙醚、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸銅( CuSO4，5H2O)、亞甲藍、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀、甲基紅、葡萄糖，分析純：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；水，實驗室三級用水。
85%乙醇：量取85 m L無水乙醇，用水定容至100m L。
淀粉酶溶液(5 g/L)：稱取0.5 g淀粉酶，用100m L水溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用；碘溶液：稱取1.3 g碘、3.6 g碘化鉀，用水溶解并定容至100 m L。
鹽酸溶液(1+1)：將鹽酸和水按體積比1：1進行混合。
甲基紅指示液(2 g/L)：稱取0.20 g甲基紅，用少量95%乙醇溶解并定容至100 m L。
氫氧化鈉溶液( 200 g/L)：稱取20 g氫氧化鈉， 用水溶解并定容至100 m L。
堿性酒石酸銅甲液：稱取15 g硫酸銅
( CuS04. 5H20)和0.050 g亞甲藍，用水溶解并定容 至1 000 m L。
堿性酒石酸銅乙液：稱取50 g酒石酸鉀鈉、75 g 氫氧化鈉和4g亞鐵氰化鉀，用水溶解并定容至1 000 m L，貯存于橡膠塞玻璃瓶內(nèi)。
葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取1g（精確至0.000 1 g）經(jīng)過98℃～100℃干燥2h的葡萄糖，用水溶解后加入5m L鹽酸，并以水定容至1 000 m L，該溶液每毫升相當(dāng)于1.0 mg葡萄糖。
1.2儀器及設(shè)備
AL204型電子天平(0.000 1～210 g)：梅特勒一托利多儀器有限公司；GZX-9070MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱（室溫5℃～250 ℃）：上海博迅實業(yè)有限公司。
1.3方法
1.3.1 淀粉測定方法及原理
1.3.1.1試樣、淀粉試劑和空白試劑的處理
將試樣磨碎過200目篩，稱取0.65～0.70 g（精確至0.000 1 g）置于放有折疊濾紙的漏斗內(nèi)。先用50 m L乙醚分5次洗除脂肪，再用150 m L 85%乙醇洗去可溶性糖類，濾去乙醇，將殘留物移入250 m L燒杯內(nèi)，用50 m L水洗濾紙，洗液并人燒杯內(nèi)，將燒杯置于沸水浴中加熱15 min，使淀粉糊化，室溫放冷至60℃以下，加入20 m L淀粉酶溶液，在55℃~60℃保溫1h，并不斷攪拌。然后取1滴該溶液加1滴碘溶液，應(yīng)不顯藍色；若顯藍色，則將該洗液再加熱糊化并加入20m L淀粉酶溶液于55℃～60℃繼續(xù)保溫，直至該溶液加碘溶液不顯藍色為止。然后加熱至沸，室溫冷卻后 移人250 m L容量瓶中定容、混勻，將其過濾，棄去初濾液，取50 m L濾液于250 m L錐形瓶中，加5 m L鹽酸(1+1)，裝上回流冷凝裝置，在沸水浴中回流1 h，室溫冷卻后加兩滴甲基紅指示液，以200 g/L的氫氧化鈉溶液中和至中性，再將其轉(zhuǎn)入100 m L容量瓶內(nèi)，洗滌錐形瓶的洗液并入該容量瓶中，然后定容、混勻。
將淀粉試劑按照GB/T 5009.3-2010“食品中水分的測定第一法直接干燥法”進行干燥，然后稱取0.45～0.50 g（精確至0.0001 g）干燥后的淀粉試劑，按上述方法進行處理。
量取50 m L水和與試樣處理時相同量的淀粉酶溶液，按上述方法進行處理。
1.3.1.2標(biāo)定堿性酒石酸銅溶液
分別吸取堿性酒石酸銅甲液、堿性酒石酸銅乙液各5 m L置于150 m L錐形瓶中，加10 m L水、兩粒玻璃珠，從滴定管中滴加9 m L左右的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，控制在2 min內(nèi)加熱至沸，趁沸以2 s／滴的速度繼續(xù)滴加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，直至溶液藍色剛好褪去為終點，記錄此時消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的總體積，同時做3份平行，取其平均值V初，計算每10 m L堿性酒石酸銅溶液（甲液和乙液各5 m L）相當(dāng)于葡萄糖的質(zhì)量A1( mg)。
1.3.1.3試樣溶液測定
分別吸取堿性酒石酸銅甲液和堿性酒石酸銅乙液各5 m L置于150 m L錐形瓶中，加10 m L水、兩粒玻璃珠，從滴定管中滴加8～9 m L的試樣溶液至錐形瓶中，控制在2 min內(nèi)加熱至沸，趁沸以2 s／滴的速度繼續(xù)滴加樣液，直至溶液藍色剛好褪去為終點，記錄此時消耗樣液的總體積，同時做3份平行，取其平均消耗體積V。
1.3.1.4淀粉含量測定試驗
同時按照1.3.1.3對空白和淀粉試劑做淀粉含量測定試驗。對空白試驗而言，只要測定用試劑不含淀粉、糖分等，理論上加入無窮大量空白溶液對堿性酒石酸銅溶液進行滴定，其藍色都不會褪色。所以正常情況下，實際測定中，測定用試劑均不含上述物質(zhì)，空白試驗的滴定體積V→∞，葡萄糖含量A0→0。
1.3.2結(jié)果計算
淀粉試劑中淀粉含量，按式(2)進行計算。
每個淀粉試劑樣品做2個獨立平行樣（每個獨立平行樣下各有3次平行測定），結(jié)果以算術(shù)平均值計，保留到小數(shù)點后1位。
試樣中淀粉含量，按式(3)進行計算。
每個試樣做2個獨立平行樣（每個獨立平行樣下各有3次平行測定），結(jié)果以算術(shù)平均值計，保留到小數(shù)點后1位。
1.3.3精密度
在重復(fù)性條件下，所得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值須小于等于算術(shù)平均值的10%。
2結(jié)果與分析
試驗表明，正常情況下按照GB/T 5009.9-2008“食品中淀粉的測定第一法酶水解法”規(guī)范測定干燥后的淀粉試劑的淀粉含量，其結(jié)果X處于95%～103%之間，與100%有一定偏差（偏差可能由淀粉試劑的純度、含水量、水解的完全程度、洗滌流失量、滴定終點判斷及操作系統(tǒng)誤差等所致），但其偏離程度都在精密度范圍內(nèi)。如果偏離度超出精密度范圍，就必須考慮測定過程中水解是否徹底，洗滌流失量是否過大，滴定過程中人為讀數(shù)、觀測或操作是否規(guī)范、合理，測定用試劑是否失效，從而導(dǎo)致試驗結(jié)果出現(xiàn)較大偏差，就需要及時改進以確保試驗結(jié)果的準(zhǔn)確度。所以，在酶水解法中，除了要做空白試驗，同時也需要做淀粉試劑（已知淀粉含量且含量穩(wěn)定）的淀粉測定，以該結(jié)果對照、核實試驗測定過程中的偏差。如果偏差過大，即可判斷測定過程中存在不規(guī)范操作，須找出不妥之處加以改進，重新對待測試樣和淀粉試劑進行測定；如果淀粉試劑的淀粉含量X1處于合理范圍內(nèi)，則試樣測定值可除以X進行校正，以減小測定過程中的主客觀偏差，使測定結(jié)果更準(zhǔn)確、可靠。
結(jié)合GB/T 5009.9-2008“食品中淀粉的測定第一法酶水解法”，與堿性酒石酸銅溶液相當(dāng)?shù)钠咸烟堑牧緼1的計算結(jié)果見表1，試樣淀粉含量和淀粉試劑淀粉含量的測定結(jié)果分別見表2和3。
按照GB/T 5009.9-2008“食品中淀粉的測定第一法酶水解法”對樣品進行淀粉含量測定，根據(jù)表2的試驗結(jié)果，其值為64.8 g/100 g；通過對照試驗，結(jié)合表3的試驗數(shù)據(jù)（950/0≤98.0%≤103%，在精密度范圍內(nèi)），試樣測定結(jié)果校正為64.8/98.0%=66.1 g/100g，該結(jié)果減小了測定過程中人為操作、樣品自身水解等因素造成的主客觀影響，其準(zhǔn)確度更高。
3結(jié)論
對食品中淀粉含量進行測定時，不僅要做試劑空白試驗以消除試劑中淀粉、糖分等的干擾，同時還要做淀粉試劑淀粉含量測定對照試驗，以核實操作過程的規(guī)范性，并且對試樣測定數(shù)據(jù)進行偏離校正，以確保得到更為準(zhǔn)確的結(jié)果。
