LC-MS法測定四種果蔬中的有機酸
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劉曉雪1，張華2，張志豐1，王雪飛1*
1．黑龍江東方學院（哈爾濱150086）；2．哈爾濱工業(yè)大學（哈爾濱150006）
摘要采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對橘子、樹莓、甘藍和菠菜中的6種有機酸（酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸和馬來酸）進行檢測。選用ACQUITY UPLC~ HSST3色譜柱進行分離，0.1%甲酸／乙腈溶液-0.1%甲酸／水體系作為流動相進行梯度洗脫，流速為0.25 m L/min，選擇ESI-多反應監(jiān)測模式進行掃描。6種有機酸的平均回收率為77.9%~104.0%，相對標準偏差RSD值為2.0%~12.4%，相關(guān)系數(shù)R2>0.998 9，該方法的最低檢出限的分別為0.02 mg/kg和0.05 mg/kg，最低定量限分別為0.1 mg/L和0.25 mg/L。準確、高效地測出了四種果蔬中有機酸的含量。
關(guān)鍵詞超高效液質(zhì)聯(lián)用儀；有機酸：果蔬
果蔬中有機酸的含量和種類對果實的品質(zhì)以及食用時人的口感風味有著重要影響…。有機酸是人體活動過程中不可少的成分，大多數(shù)有機酸可直接參與生命活動，而有機酸的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)以及含量的多少對人體的健康有著很重要的作用。有機酸可促進鈣、鐵離子的吸收、提高機體免疫力、促進人體內(nèi)的新陳代謝以及改善內(nèi)分泌失調(diào)等作用。如今國內(nèi)外關(guān)于果蔬中有機酸的檢測方法已有很多，方法也比較成熟，例如比色法、滴定法、分光光度法、熒光法、薄層色譜法、毛細管電泳法、離子色譜法、氣相色譜法、氣質(zhì)譜聯(lián)用法和高效液相色譜法等，這些檢測方法的適用范圍受限，受雜質(zhì)干擾嚴重，靈敏度低，前處理方法復雜，分析檢測范圍窄等不足。因此，研究建立了LC-MS法測定果蔬中的有機酸來改善以上檢測方法的不足，建立一個靈敏度高、檢測范圍廣、檢出限低的檢測方法。
1 試驗材料與方法
1.1試驗材料
飲用純凈水：黑龍江省虎林哇哈哈飲料有限公司；甲酸、乙腈：色譜純，純度為98%，F(xiàn)luka有限公司；乙醇：色譜純，純度為90%，F(xiàn)luka有限公司；異丙醇5%、甲醇5%;磷酸：分析純，純度為98%，天津市天力化學試劑有限公司；甲醇：
色譜純，純度為99.9%，上海SIGMA-ALDRICH
1.2儀器與設(shè)備
ACQUITY UPLC XEV0 7G超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Waters公司；ACQUITY UPLC~ HSS T3色譜柱：美國Waters公司；電子天平：METTLERTOLEDO公司；GX-274固相萃取裝置：GILSON公司；IKA RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：德國IKA公司；MTN2800D氮吹儀：OA-SYS公司；IKA MS3旋渦混勻器：德國IKA公司；2094組織搗碎機：FOSS公司；T25均質(zhì)機：德國IKA公司；L550離心機：湘儀離心機有限公司。
1.3試驗方法
1.3.1流動相的配制
流動相A（0.1%甲酸-乙腈溶液）：取300μL甲酸溶液再向其中加入乙腈溶液至300 m L，過0.22μm尼龍油膜抽濾，混勻即可。
流動相B（0.1%甲酸-水溶液）：取300μL甲酸溶液再向其中加入飲用純凈水溶液至300 m L，過0.22 μm尼龍水膜抽濾，混勻即可。
流動相C（弱洗溶液）：取30 m L飲用純凈水溶液再向其中加入270 m L乙腈溶液，過0.22 μm尼龍油膜抽濾，混勻即可。
流動相D（強洗溶液）：取270 m L飲用純凈水溶液再向其中加入30 m L乙腈溶液，過0.22μLm尼龍油膜抽濾，混勻即可。
1.3.2 有機酸標準儲備溶液
分別稱取0.01 mg的檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、富馬酸、蘋果酸和馬來酸；用飲用純凈水充分溶解，再定容到100 m L。檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、富馬酸、蘋果酸和馬來酸的質(zhì)量濃度分別為100 μg/m L，此溶液為標準儲備液。分別吸取上述儲備溶液1 m L用飲用純凈水定容到100 m L，各有機酸質(zhì)量濃度為1μg／m L，作為使用標準溶液。在±4℃的溫度下儲存。
1.3.3 儀器條件
1.3.3.1色譜條件
T3色譜柱，流動相為0.1%甲酸／乙腈溶液-0.1 %甲酸／水體系，流速為0.25 m L/min，柱溫為50℃，進樣體積為5μL。流動相采用梯度洗脫的形式進行試驗，最終得到最佳梯度洗脫條件（見表1）。
1.3.3.2質(zhì)譜條件
電噴霧離子源( ESI)，負離子掃描模式，多反應監(jiān)測，樣品室溫度為5 0C，毛細管電壓為2.5 kV，錐孔電壓為20 V，射頻透鏡為0.1 V，離子源溫度為150 0C，脫溶劑溫度為450℃，脫溶劑氣流量為650L/h，錐孔氣流速為50 L/h，毛細管氣流速為0.22 m L/min。通過以上質(zhì)譜條件對目標化合物的離子對進行摸索，最終確定各種目標化合物的離子對條件(見表2)。
1.3.4 樣品的制備
稱取400.0 g果蔬樣品放入均質(zhì)機中進行攪碎，將其作為儲備樣品使用。稱取上述試驗樣品3.00 g于離心管中，再向其中加入30 m L飲用純凈水，進行均質(zhì)提取后，放入離心機中以3 000 r/min離心4 min分-出上清液，放入100 m L容量瓶中。殘渣再用30 m L飲用水進行上述提取然后合并上清液于容量瓶中，用乙醇定容到刻度線，混勻，作為提取溶液。過濾出5 m L清液于雞心瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在80℃下進行蒸干。再用5 m L的5%磷酸-水溶液定容，用旋渦混勻器混勻，然后過6 m L SAX固相萃取柱。先用5 m L甲醇、5 m L水進行活化SAX固相萃取柱，活化結(jié)束后將5%磷酸-水溶液定容的樣液加入到SAX柱內(nèi)，待樣液過柱后，用5m L水、5 m L甲醇淋洗，再用5%磷酸-甲醇洗脫，收集5 m L的5%磷酸-甲醇洗脫液于試管中，N2吹至近干。用1mL流動相進行定容，旋渦混勻器混勻，過0.22μm水膜于進樣瓶中，待測。
2結(jié)果與討論
2.1線性范圍和方法檢出限
將質(zhì)量濃度范圍為0～2 000 μg/L的六種有機酸標準儲備液(1.3.2)分別由低濃度向高濃度注入到超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中得到不同有機酸標準溶液的峰面積( Area)。以有機酸對照品溶液的峰面積為縱坐標，有機酸對照品溶液質(zhì)量濃度( mg/L)為橫坐標制作標準曲線，計算回歸方程和線性系數(shù)。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0～1 000 μg/L范圍內(nèi)富馬酸和馬來酸線性關(guān)系較好，在0～2 000ILg/L范圍內(nèi)蘋果酸、檸檬酸、酒石酸和琥珀酸的線性關(guān)系較好。相關(guān)系數(shù)R2達到0.998 9～0.999 8。最低檢出限的分別為0.02 mg/ kg和0.05 mg/kg，最低定量限分別為0.1 mg/L和0.25 mg/L
（見表3）。
2.2 回收率和精密度
向甘藍和樹莓樣品中分別添加6種有機酸的混合標準品后按照(1.3.4)的步驟進行回收試驗的驗證，加入的混合標準品的質(zhì)量濃度分別為0.2，0.5和1μg/m L，每個加標濃度都進行6次平行試驗。
結(jié)果證明甘藍在不同濃度下的平均回收率的范圍為81.1%～102.2%之間，相應的RSD值范圍是2.0%，7.3%（見表4）。樹莓在不同濃度下的平均回收率的范圍為77.9%~104.0%之間，相對標準偏差RSD值的范圍為2.5%~12.4%之間（見表5）說明該試驗的回收率和精密度較好。
2.3穩(wěn)定性和準確度
將添加過標準品的樣品（質(zhì)量濃度為1μg/m L）于4℃條件下冷藏，第3天測定樣品峰面積的變化，第6天測定樣品峰面積的變化，測定時每個樣品重復進樣6次，通過峰面積的響應值來比較樣品的穩(wěn)定性以及準確度。
存儲過的加標樣品上機測定結(jié)果如圖1所示，六種有機酸色譜圖的峰面積值在第3天與第6天幾乎無明顯變化，相對標準偏差RSD值的范圍在1.29%~9.99%之間，說明該試驗方法的穩(wěn)定性和準確度較好。
2.4樣品測定
研究選用了橘子、樹莓、甘藍和菠菜進行6種有機酸的測定，試驗方法按(1.3.4)進行處理樣品。
結(jié)果證明水果蔬菜中所含的有機酸各不相同，每種有機酸的含量也不同。4種果蔬的測定結(jié)果(見表6)。橘子、樹莓、甘藍和菠菜4種果蔬中都含有蘋果酸，無琥珀酸、馬來酸和富馬酸。4種果蔬中除了含有蘋果酸外，橘子和菠菜中含有檸檬酸，樹莓中含有檸檬酸和酒石酸。
3結(jié)論
研究建立了超高效液質(zhì)聯(lián)用法測定4種果蔬中的有機酸。有機酸標準溶液的譜圖和4種果蔬樣品的譜圖見圖2～6。由圖可知，有機酸標準溶液能達到很好的分離效果，而且樣品雜質(zhì)能與有機酸很好的分離，準確測定出4種果蔬中有機酸的成分以及含量。說明LC-MS法能準確、快速地測定果蔬中的有機酸。
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