間歇式微波處理提取銀杏愈傷組織黃酮的研究
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鄧祥宜1，林立春1，李艷玲1，熊蘇舒1，羅云桃1，周竹青2*
1．武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院（武漢430205）；2．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院（武漢430070）
摘要 以銀杏愈傷組織為原料，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了間歇式微波處理提取黃酮的工藝條件。試驗(yàn)結(jié)果表明，響應(yīng)面試驗(yàn)的最佳提取條件是乙醇體積分?jǐn)?shù)48.09%，液料比值35 m L/g，微波時(shí)間84.44 s；驗(yàn)證性試驗(yàn)中此條件下的黃酮得率為17.207 mg/g，與預(yù)測值17.114 mg/g非常接近。
關(guān)鍵詞銀杏愈傷組織；黃酮；提取條件優(yōu)化；響應(yīng)面分析
銀杏的主要活性成分是黃酮類化合物，其以黃酮糖苷和黃酮苷元的形式存在，在乙醇水溶液中溶解較好。銀杏黃酮具有抗氧化、降血脂、抗炎癥、抗腫瘤、抑菌和抗病毒等功能，在臨床治療和保健方面擁有獨(dú)特的價(jià)值。銀杏愈傷組織黃酮含量高于葉片，具有一定的應(yīng)用前景。目前，關(guān)于銀杏葉片黃酮提取方法的研究較多，而對(duì)銀杏愈傷組織中黃酮提取條件的研究較少。
微波輔助提取是快速而有效的提取方法，但微波處理過度會(huì)造成以槲皮素為苷元的糖苷的降解，這可能與微波引起的熱效應(yīng)有關(guān)，采用間歇式的微波處理，是避免升溫過高導(dǎo)致黃酮破壞的有效方法。前期試驗(yàn)結(jié)果表明，微波輔助水浴浸提法能較好地提取銀杏愈傷組織黃酮，單次得率達(dá)到77.95%，但水浴浸提過程僅使得黃酮得率在微波處理的基礎(chǔ)上提高了5.5%，從簡化提取工序、降低能耗等方面考慮，可刪除水浴處理過程，直接運(yùn)用微波處理來提取銀杏愈傷組織黃酮。試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)間歇式微波處理提取銀杏愈傷組織黃酮的工藝條件進(jìn)行研究，以期為組織培養(yǎng)生產(chǎn)銀杏黃酮作鋪墊。
1 材料與方法
1.1 材料及主要儀器設(shè)備
銀杏愈傷組織：武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其它試劑均為分析純。
WFZ UV-2000型紫外可見分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；DH6-914385-Ⅲ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；P80D-23NIP-B5( BO)微波爐：佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1愈傷組織的培養(yǎng)及收獲
愈傷組織培養(yǎng)、收獲方法。
1.2.2黃酮提取工藝流程及測定方法
銀杏愈傷組織粉末0.2 g→加入乙醇水溶液→搖勻后微波處理（間歇式微波處理：每處理5s，水浴冷卻一次；功率為中火528 W）~4 000 r/min離心15 min→取上清液測定黃酮含量，計(jì)算得率
黃酮含量測定方法采用Al(NO3)3顯色法，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=1.313 5x-0.024 3，其
中，y-OD540，x-蘆丁含量(mg)，R2=0.999 5。
1.2.3微波處理方式的比較
稱取2份0.200 g銀杏愈傷組織粉末，分別加入5m L 40%的乙醇溶液，微波處理60 s，一組以間歇式的微波處理方法，每處理5s水浴冷卻一次，一共處理60s；另一組以連續(xù)式微波處理的方式，一次性加熱60 s。黃酮提取和含量測定其他操作參照1.2.2進(jìn)行。每個(gè)梯度做2個(gè)平行，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。
1.2.4單因素試驗(yàn)方法
乙醇體積分?jǐn)?shù)的優(yōu)化：稱取9份0.200 g銀杏愈傷組織粉末于10 m L離心管中，分別加入5 m L的0，30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%和100%的乙醇溶液，微波處理60 s，黃酮提取和含量測定其他操作參照1.2.2進(jìn)行。每個(gè)梯度做2個(gè)平行，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。
液料比值的優(yōu)化：保持提取劑（40%乙醇溶液）體積不變，改變愈傷粉末重量，研究液料比值為10，20，25，30，40，50和100 m L/g對(duì)黃酮得率的影響。微波處理60 s，黃酮提取和含量測定其他操作參照1.2.2進(jìn)行。每個(gè)梯度做2個(gè)平行，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。
微波處理時(shí)間的優(yōu)化：稱取8份0.200 g銀杏愈傷組織粉末，分別加入5 m L的40%的乙醇溶液，微波處理時(shí)間梯度為0，10，30，60，90，120，180和240s。參照1.2.2進(jìn)行黃酮提取和含量的測定。每個(gè)梯度做2個(gè)平行，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。
1.2.5響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)
根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用Design-Expert 8.0.6.0軟件設(shè)計(jì)中心組合試驗(yàn)，建立黃酮提取模型，預(yù)測最佳提取條件和黃酮得率。試驗(yàn)因子編碼及水平設(shè)計(jì)見表1。
1.2.6驗(yàn)證性試驗(yàn)
在響應(yīng)面分析的最優(yōu)工藝條件下進(jìn)行5次重復(fù)提取，驗(yàn)證模型的可靠性。
2結(jié)果與分析
2.1微波處理方式對(duì)黃酮得率的影響
不同微波處理方式對(duì)黃酮得率影響的試驗(yàn)結(jié)果（圖1）顯示：間歇式處理的黃酮得率為16.43 mg/g，高于連續(xù)式處理的得率14.24 mg/g。試驗(yàn)中觀察到，連續(xù)式處理導(dǎo)致了提取劑的暴沸，使得一些原料粉末濺到容器壁上，不利于提�。煌瑫r(shí)，該過程溫度較高，可能導(dǎo)致黃酮被破壞，所以試驗(yàn)采用間歇式微波處理的方式。
2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率的影響
試驗(yàn)結(jié)果（圖2）顯示：當(dāng)用乙醇體積分?jǐn)?shù)為0時(shí)，黃酮的得率為6.03 mg/g;隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)提高，黃酮得率呈現(xiàn)出遞增的趨勢，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，黃酮的得率達(dá)到最大，為15.84 mg/g;之后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)一步升高，黃酮的得率呈現(xiàn)下降的趨勢，用無水乙醇提取時(shí)，黃酮的得率僅為7.23 mg/g。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)50%為最佳體積分?jǐn)?shù)。
2.3液料比值對(duì)黃酮得率的影響
液料比值對(duì)黃酮得率影響的試驗(yàn)結(jié)果（圖3）表明：當(dāng)液料比值為10 m L/g時(shí)，黃酮得率為9.14 mg/g;隨著液料比值逐漸增大，黃酮的得率大幅增加，當(dāng)液料比值為30 m L/g時(shí)，黃酮的得率為16.43 mg/g；接著，黃酮得率雖然隨著液料比值的增大繼續(xù)增大，但是上升趨勢減小�；诠�(jié)約成本等考慮，選擇30 m/g為最佳液料比值。
2.4微波處理時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響
不同微波處理時(shí)間對(duì)黃酮得率影響的試驗(yàn)結(jié)果（圖4）表明：當(dāng)微波處理時(shí)間為Os時(shí)，黃酮得率為7.98 mg/g；隨著微波時(shí)間的增加，黃酮得率逐漸增加，微波時(shí)間為60 s時(shí)，黃酮得率達(dá)到15.62 mg/g;超過60 s后，黃酮得率趨于穩(wěn)定并在180 s后表現(xiàn)出輕微的下降趨勢。這可能是因?yàn)槲⒉ㄌ幚碛欣邳S酮的溶出，但處理時(shí)間過長可能造成少量黃酮被破壞。故選取60 s為最佳微波時(shí)間。
2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析
中心組合試驗(yàn)結(jié)果見表2，利用Design-Expert 8.0.6.0軟件進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析，得到黃酮提取模型的
方差分析結(jié)果見表3�；貧w模型p<0.000 1<0.01，說明模型極顯著；失擬項(xiàng)p=0.077 3>0.05，不顯著，說明模型擬合度良好，無失擬因素存在；R2Adj=0.947 2>0.80，說明該模型94.72%的變化都與試驗(yàn)因素有關(guān)，變異系數(shù)(c．v．)為2.03%，說明該模型只有2.03%的變異，進(jìn)一步說明該模型擬合度高，所以可以用該模型模擬各因素對(duì)黃酮得率的影響。
交互項(xiàng)AB、AC和BC的P均大于0.05，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比值、乙醇體積分?jǐn)?shù)與微波時(shí)間、液料比值和微波時(shí)間的交互作用項(xiàng)不顯著。模型二次項(xiàng)系數(shù)全為負(fù)，結(jié)合響應(yīng)面圖（圖5）看出，回歸方程存在頂點(diǎn)，說明響應(yīng)值有最大值。通過軟件D e sign-Expert 8.0.6.0預(yù)測出最優(yōu)提取工藝：乙醇體積分-數(shù)48.09%，液料比值35 m L/g，微波時(shí)間84.44 s，此條件下的預(yù)測值為17.144 mg/g。
2.6驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果及分析
驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果（表4）表明：在響應(yīng)面最優(yōu)條件下，總黃酮得率為17.207 mg/g，與預(yù)測值17.144 mg/g接近。
3結(jié)論與討論
通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)得到了銀杏愈傷組織黃酮提取的最優(yōu)條件：以48.09%乙醇為提取劑，液料比值為35 m L/g，在中火檔(528 W)微波處理84.44s。該條件下的黃酮得率17.207 mg/g，與預(yù)測值17.114mg/g-致。
試驗(yàn)最優(yōu)條件下的黃酮得率較之前研究( 20.92mg/g)偏低，這是因?yàn)樵囼?yàn)與之前的研究使用了同一批材料，該材料儲(chǔ)存了約9個(gè)月，黃酮含量有所下降（數(shù)據(jù)未展示）。可見，在愈傷組織收獲之后，應(yīng)盡快進(jìn)行黃酮的提取和含量測定。
