響應面優(yōu)化復合酶制備中華蜂蛹活性肽工藝研究
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張國良
廣西工商職業(yè)技術(shù)學院（南寧530007）
摘要 以中華蜂蛹為原料，研究復合酶制備中華蜂蛹蛋白肽的工藝。以中華蜂蛹蛋白肽的肽得率為參考指標，確定了木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶添加順序和添加比例。采用單因素法確定酶解最佳工藝參數(shù)，響應面法優(yōu)化復合酶酶法制備中華蜂蛹蛋白肽的工藝條件。研究結(jié)果表明，制備中華蜂蛹蛋白肽的最佳工藝條件為：木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶添加比例按酶活力比2:1同時添加，酶用量4 503.5 U/g，底物濃度4.5%，pH 8.3，酶解溫度59.9℃，在該工藝條
件下中華蜂蛹蛋白肽的肽得率可達65.2%。
關(guān)鍵詞 中華蜂蛹；蛋白肽：酶解；肽得率；響應面法
中華蜂，又稱中華蜜蜂、中蜂、土蜂，為東方蜜蜂的一個亞種，是中國獨有的蜜蜂當家品種，也是以雜木樹為主的森林群落及傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)的主要傳粉昆蟲。蜂蛹含有豐富的人體所需的營養(yǎng)成分，是優(yōu)良的營養(yǎng)來源。蛋白肽是中華蜂蛹的有效成分。研究表明蛋白肽能降血壓、增強機體免疫能力、抗氧化和抗菌等。目前，我國動物蛋白水解物的研究主要集中食用價值高的肉體部分，因此，用酶法制備中華蜂蛹蛋白肽具有重要的意義。利用響應面分析法對中華蜂蛹蛋白肽的制備條件進行優(yōu)化，以期為中華蜂蛹的綜合利用提供理論基礎(chǔ)。
1材料及方法
1.1原料與試劑
中華蜂蛹：采集于當?shù)刂腥A蜂養(yǎng)殖基地；硅藻土：實驗室提供；木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶：廣州華美試劑有限公司；三氯乙酸、福林一酚試劑、凱氏定氮試劑：東莞信惠試劑有限公司。
1.2試驗儀器與設備
WDJ系列漩渦式粉碎機：上海百申儀器設備有限公司；KDN-1000全自動凱氏定氮儀：上海惠譜儀器有限公司；GT10-1高速離心機：東莞普生儀器廠；GZX-9070 MBE電熱恒溫鼓風干燥箱：東莞華生儀器廠；SZCL-2A型恒溫磁力攪拌器：杭州市佳華儀器有限公司；HH-WO電熱恒溫水浴鍋：廣州嘉華儀器有限公司；GTR16-2高速冷凍離心機：上海百申儀器設備有限公司；等。
1.3試驗方法
1.3.1 酶解工藝流程
1.3.2 中華蜂蛹蛋白肽的測定
TCA法（三氯乙酸可溶性氮法）測定肽得率：將15%三氯乙酸與蛋白酶水解液1：1混合，離心(5 000 r/min，15 min)，取上清液采用福林一酚法測其可溶性氮。
（凱氏定氮法測定），mg。
1.3.3確定復合酶添加順序
酶解條件為酶活力比1：1，酶用量4 500 U/g，底物濃度5%，pH 8.0，酶解溫度55℃。
1)酶添加順序為先添加木瓜蛋白酶后添加堿性蛋白酶。
2)同時添加木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶。
3)先添加堿性蛋白酶后添加木瓜蛋白酶。
以肽得率為指標確定酶的添加順序。
1.3.4確定復合酶添加比例
木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶按酶活力比為3:1，2：1.1：1，0：1，1：0，1：2和1:3添加，兩種酶同時添加，其他同1.3.3。
1.3.5復合酶制備中華蜂蛹蛋白肽條件的優(yōu)化
通過單因素試驗考察酶用量、底物濃度、pH和酶解溫度對中華蜂蛹蛋白肽制備效果影響，在選取各因素的最優(yōu)試驗范圍，采用響應面分析法對中華蜂蛹蛋白肽制備條件進行優(yōu)化。
2結(jié)果與分析
2.1木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶添加順序?qū)χ腥A蜂蛹蛋白肽肽得率的影響
由圖1可知，當木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶同時添加(b)時，肽得率較高。這是因為兩種酶彼此之間存在協(xié)同作用，提高了肽得率。故選擇木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶的添加順序為同時添加。
2.2木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶添加比例對中華蜂蛹蛋白肽肽得率的影響
由圖2可知，木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶以2:1活力比添加時的肽得率較高，高于按其他比例或者單獨添加某種酶的肽得率。故選擇木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶的添加比例為2:1。
2.3復合酶制備中華蜂蛹蛋白肽條件的優(yōu)化
2.3.1酶用量對中華蜂蛹蛋白肽制備效果的影響
設定底物濃度為5%，pH 8.0，酶解溫度為550C，分別在酶用量為3 900，4 100，4 300，4 500，4 700和4 900 U/g六個梯度下，按方法1.3.1制備中華蜂蛹蛋白肽。由圖3可以看出，酶用量應控制在4 500 U／g左右較為適宜。
2.3.2底物濃度對中華蜂蛹蛋白肽制備效果的影響
設定酶用量4 500 U/g，pH 8.0，酶解溫度為550C，分別在底物濃度為1%，3%，5%，7%，9%和11%六個梯度下，按方法1.3.1制備中華蜂蛹蛋白肽。由圖4可以看出，底物濃度控制在5%左右較為適宜。
2.3.3 pH對中華蜂蛹蛋白肽制備效果的影響
設定酶用量4 500 U/g，底物濃度為5%，酶解溫度為55℃，分別在pH為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0和10.0六個梯度下，按方法1.3.1制備中華蜂蛹蛋白肽。由圖5可以看出，pH應制在8.0左右較為適宜。
2.3.4酶解溫度對中華蜂蛹蛋白肽制備效果的影響
設定物酶用量4 500 U/g，底物濃度為5%，pH8.0，分別在酶解溫度為50℃，55℃，60℃，65℃．70℃和75℃六個梯度下，按方法1.3.1制備中華蜂蛹蛋白肽。由圖6可以看出，酶解溫度應控制在60℃左右較為適宜。
2.3.5中華蜂蛹蛋白肽制備條件的優(yōu)化試驗
在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取酶用量，底物濃度，pH，酶解溫度各因素的最優(yōu)試驗范圍，按照表1的因素水平表，以中華蜂蛹蛋白肽肽得率為響應值，采用響應面分析法對中華蜂蛹蛋白肽制備條件進行優(yōu)化。試驗結(jié)果，回歸方程圖及響應面方差分析結(jié)果見表2和表3。
根據(jù)中華蜂蛹蛋白肽制備的試驗結(jié)果，由響應面分析法得出關(guān)于中華蜂蛹蛋白肽肽得率的二次回歸擬合方程：
其中：A為酶用量，B為底物濃度，C為pH，D為酶解溫度。
對中華蜂蛹蛋白肽制備的試驗結(jié)果進行多元回歸分析，由回歸方程各項的方差分析結(jié)果（表3）可以看出，模型的F直為26 458.53，p<0.000 1，表明模型極顯著，同時A酶用量，B底物濃度，C pH和D酶解溫度都是顯著因素，A酶用量與B底物濃度，C pH交互作用都顯著；B底物濃度與C pH和D酶解溫度的交互作用也都顯著；C pH與D酶解溫度的交互作用也顯著。而失擬項的F=1.30，p=0.367 1，說明了該模型與中華蜂蛹蛋白肽制備實際情況擬合程度比較好，可以預測中華蜂蛹蛋白肽制備最佳條件。即酶用量4 503.5U/g，底物濃度4.5%，pH 8.3，酶解溫度59.9℃。
3結(jié)論
復合酶添加順序為木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶同時添加。而且，木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶的添加比例為2：1。
中華蜂蛹蛋白肽制備最佳工藝條件為酶用量4 503.5 U/g，底物濃度4.5%，pH 8.3，酶解溫度59.9℃。在該工藝條件下中華蜂蛹蛋白肽的肽得率可達65.2%。
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