黑曲霉植酸酶對(duì)豆粕中植酸的脫磷作用
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王陶，李文，董玉瑋，高明俠，李同祥*
徐州工程學(xué)院，江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室（徐州221008）
摘要單胃動(dòng)物不能有效利用植物性飼料中的磷，因?yàn)榱字饕灾菜崃椎男问酱嬖凇ＭǔＭㄟ^在飼料中添加植酸酶，水解植酸脫磷，來提高動(dòng)物對(duì)磷的利用率。利用黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的植酸酶粗酶液對(duì)豆粕中的植酸進(jìn)行脫磷作用研究。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定植酸酶水解豆粕中植酸的最適條件為：酶加量為600 U/g，底物濃度為60 mg/m L, pH為4，溫度為55C,脫去無機(jī)磷的量為4.127 mg/g。最優(yōu)條件下，豆粕中植酸水解5 h后的水解率為87.34%。
關(guān)鍵詞 黑曲霉；植酸酶；豆粕；脫磷
植酸酶( Phytases)是水解植酸（肌醇六磷酸）或植酸鹽一類酶的總稱，廣泛存在于微生物中。細(xì)菌、酵母菌、霉菌和多種多細(xì)胞真菌均能產(chǎn)生植酸酶，其產(chǎn)植酸酶的性質(zhì)各異。根據(jù)最適pH的不同，植酸酶可分為酸性植酸酶、中性植酸酶和堿性植酸酶，而微生物植酸酶因活性高、生產(chǎn)比較容易等諸多優(yōu)點(diǎn)，對(duì)其研究和開發(fā)最為廣泛和深入。植酸酶可以提高飼料中磷的利用率，解除飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的利用率，降低動(dòng)物糞便中磷的含量，減少對(duì)周圍環(huán)境的污染，提高飼料干物質(zhì)的表觀消化率和存留率，植酸酶還可以提高氨基酸和氮的表觀消化率。鑒于植酸酶的廣泛作用，已經(jīng)成為酶制劑和飼料添加劑研究熱點(diǎn)。目前，植酸酶廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)和飼料工業(yè)中，它能使植物性飼料中磷的利用率提高60%，糞便中磷的排出量減少40%，從而減少飼料中磷的添加量，降低對(duì)環(huán)境污染；它還可破壞植物性飼料或食品中植酸與礦物元素及蛋白質(zhì)的親和力，提高礦物元素生物利用率和蛋白質(zhì)的消化率，從而提高食品的營養(yǎng)價(jià)值和畜牧生產(chǎn)效益。
豆粕是大豆提取豆油后得到的一種副產(chǎn)品，豆粕中富含高質(zhì)量的植物性蛋白質(zhì)、微量礦物元素和維生素，成為優(yōu)良的植物蛋白來源。作為一種高蛋白質(zhì)，豆粕是制作牲畜與家禽飼料的主要原料。植酸酶作為單胃動(dòng)物飼料添加劑的飼喂效果已被充分證明與肯定。在以玉米、豆粕和麩皮為主要成分動(dòng)物飼料中，磷的吸收率只有15%，添加植酸酶后，植酸磷的利用率一般提高20%～50%;另外，在飼料中添加植酸酶一般可降低畜禽糞便中20%～50%的磷。所以，以植酸酶代替部分或全部的磷酸氫鈣，無論是提高飼料中磷的利用率、減輕對(duì)環(huán)境的污染，還是提高養(yǎng)殖的安全性都有著重要的意義。試驗(yàn)利用篩選到的黑曲霉高產(chǎn)植酸酶菌株進(jìn)行發(fā)酵得到植酸酶粗酶液水解豆粕中的植酸，從而得到植酸酶脫磷的最適條件，為進(jìn)一步開發(fā)利用黑曲霉植酸酶提供一定理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料與試劑
黑曲霉由徐州工程學(xué)院微生物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室保存；植酸鈉（高純?cè)噭好绹鳶igma公司；偏釩酸銨（分析純）：合肥工業(yè)大學(xué)化學(xué)試劑廠；四水合鉬酸銨（分析純）：合肥工業(yè)大學(xué)化學(xué)試劑廠；三氯乙酸（分析純）：天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；其他試劑均為分析純。
1.2儀器與設(shè)備
TU-1810紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DHG-9140型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HH.B11.600-S-Ⅱ型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；HYG旋式恒溫調(diào)速搖瓶柜：上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；DL-5低速大容量離心機(jī)：常州國華電器有限公司。
1.3培養(yǎng)基
斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯150 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L。
產(chǎn)酶培養(yǎng)基：麩皮3%，(NH4)2SO45g/L，蛋白胨3 g/L, KC1 0.5 g/L, MgSO4. 7H2O0.5 g/L, MnSO4.H2O0.018 g/L, FeSO4. 7H20 0.03 g/L, pH 5.5。
麩皮在燒杯里加水在電爐上煮沸后，再煮10 min左右，用紗布過濾，取濾液。再加其他成分，最后補(bǔ)足水分。
1.4方法
1.4.1斜面活化
選用冰箱保藏的黑曲霉菌株進(jìn)行斜面活化，恒溫箱中28℃培養(yǎng)3d，觀察生長情況。
1.4.2液體發(fā)酵及粗酶液的制備
活化好的黑曲霉菌株轉(zhuǎn)接至產(chǎn)酶培養(yǎng)基搖床發(fā)酵產(chǎn)酶，裝液量100 m L（250 m L三角瓶），150 r/min．28 ℃培養(yǎng)84 h。發(fā)酵結(jié)束后，靜置10 min，往10 m L的離心管中加入5 m L的上清液，放人的低速離心機(jī)中，以4 000 r/min的速度將發(fā)酵液離心10 min，上清液即為粗酶液。
1.4.3植酸酶活測(cè)定
將4.0 m mol/L磷酸二氫鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成0.0，0.8，1.6，2.4，3.2和4.0 m mol/L的溶液。用移液管分別量取2.0，4.0，6.0，8.0和10.0 m L的4.0 m mol/L磷酸二氫鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液于5個(gè)10.0 m L容量瓶，用乙酸緩沖溶液將其定容并且搖勻。
以無機(jī)磷濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。列出直線回歸方程為y=0.002 6x-0.002 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 9。
酶活單位定義：以37℃，pH 5.5條件下，1 min從5.0 m mol/L植酸鈉溶液中水解釋放1μLmol無機(jī)磷所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位，以U表示。
對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其酶活，見式(1)。
1.4.4無機(jī)磷濃度的測(cè)定
采用Harland等的微量比色法定磷，略有改動(dòng)。
1.4.4.1工作曲線的繪制
分別取0.00，1.00，2.00，4.00，6.00，8.00．10.00, 12.00和15.00 m L磷標(biāo)準(zhǔn)溶液于50 m L容量瓶中，各加入釩鉬酸銨顯色劑10 m L，用水稀釋至刻度，搖勻，室溫下放置10 min以上，以試劑空白為參比，用1 cm比色池在420 nm下測(cè)定各溶液的吸光度，以無機(jī)磷含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線，如圖2。直線回歸方程為y=0.051 0x+0.004 8．R2=0.998 9。
1.4.4.2測(cè)定總磷和無機(jī)磷樣品的處理
總磷：準(zhǔn)確稱取試樣2～5 g于坩堝中，在電爐上小心炭化，再放人馬弗爐中，在550℃灼燒3h，取出冷卻，加入10 m L鹽酸溶液和硝酸數(shù)滴，小心煮沸數(shù)分鐘，冷卻后轉(zhuǎn)入100 m L容量瓶，用水稀釋至刻度，搖勻，過濾棄去初始的20 m L濾液，為試樣分解液。
無機(jī)磷：準(zhǔn)確稱取試樣2～5 g置于100 m L燒杯中，加10 m L鹽酸溶液和硝酸數(shù)滴，加水30 m L，攪拌數(shù)分鐘，然后定量轉(zhuǎn)入100 m L容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，過濾棄去初始的20 m L濾液，為試樣分解液。
1.4.4.3分解液和經(jīng)粗酶液浸泡的豆粕上清液中磷的測(cè)定
準(zhǔn)確吸取濾液或粗酶液浸泡的豆粕上清液2 m L于50 m L容量瓶中，加釩鉬酸銨顯色劑10 m L，用水稀釋至刻度，搖勻，室溫下放置10 min，按上述方法測(cè)定其吸光度。
磷含量計(jì)算公式，見式(2)。
1.4.5脫磷條件的優(yōu)化
將植酸酶粗酶液加入豆粕中，水解豆粕中的磷酸�；A(chǔ)條件為：在pH為5，溫度為45℃，底物濃度為50 mg/m L，水解時(shí)間為4h。
1)加酶量對(duì)無機(jī)磷含量的影響：將粗酶液加入豆粕中，考察加酶量分別為200，400，600，800和1000U/g時(shí)對(duì)麩皮上清液中無機(jī)磷量的影響，確定最佳加酶量。
2)底物質(zhì)量濃度對(duì)無機(jī)磷含量的影響：在最佳酶量下，分別考察豆粕濃度40，50，60，80和100 mg/m L時(shí)對(duì)無機(jī)磷量的影響，確定最佳底物質(zhì)量濃度。
3)溫度對(duì)無機(jī)磷含量的影響：采用最佳酶量和底物質(zhì)量濃度，分別考察溫度25℃，37℃，45 ℃，50℃和55℃時(shí)對(duì)磷量的影響，確定最佳酶解溫度。
4) pH對(duì)無機(jī)磷含量的影響：采用最佳酶量、底物質(zhì)量濃度和溫度，分別考察pH 3，4，5，6和7時(shí)對(duì)無機(jī)磷量的影響，確定最佳pH。
5)正交試驗(yàn)：結(jié)合前面的單因素試驗(yàn)，以加酶量、底物質(zhì)量濃度、溫度和pH為影響因素，選用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，確定最佳組合。
1.4.6最優(yōu)條件下豆粕中磷釋放量隨時(shí)間的關(guān)系
采用正交試驗(yàn)得到最佳的酶加量、底物濃度、水浴溫度和pH，分別考察水解1，2，3，4，5和6h上清液中磷含量的變化情況。
再考察不加酶液，其他因素采用最優(yōu)條件，分別在水中浸泡1，2，3，4，5和6h后上清液中磷含量的變化情況。
植酸磷的降解率=豆粕中已降解植酸磷量／豆粕中總植酸磷量×100% (3)
2結(jié)果與分析
2.1脫磷條件的單因素優(yōu)化
2.1.1 加酶量對(duì)脫磷作用的影響
在pH為5，溫度為45℃，底物濃度為50 mg/m L，水解時(shí)間為4h，不同黑曲霉植酸酶酶加量對(duì)豆粕中植酸的脫磷作用如圖3所示。
由圖3可以看出，在加酶量不斷增加的情況下，植酸酶的脫磷效果也不斷提高，最后趨于平穩(wěn)，可能是由于底物已經(jīng)達(dá)到飽和，再增加酶量對(duì)其磷的釋放沒有影響。當(dāng)酶加量在600～1 000 U/g時(shí)磷量增加非常小，考慮利用率和經(jīng)濟(jì)適用，所以選擇酶加量為600 U/g進(jìn)行以下條件的優(yōu)化選擇。此時(shí)，磷的釋放量達(dá)到最大，為3.379 mg/m L。
2.1.2不同底物濃度對(duì)無機(jī)磷含量的影響
在pH為5，溫度為45℃，酶加量為600 U/g，水解時(shí)間為4h，不同底物濃度脫去豆粕中磷量如圖4所示。
由圖4可知，磷釋放量隨底物濃度的增加呈先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，底物濃度為60 mg/m L時(shí)脫磷效果最佳，對(duì)豆粕的脫磷量達(dá)到最大3.627 mg/g。底物濃度超過60 mg/m L后，磷釋放量趨于平緩。若底物濃度加大，植酸酶將達(dá)到飽和，不會(huì)把所有豆粕中的植酸磷水解，使得磷釋放量最后變化不大。因此，最佳底物質(zhì)量濃度為60 mg/m L。
2.1.3不同溫度對(duì)無機(jī)磷含量的影響
在pH為5，酶加量為600 U/g，底物濃度為60 mg/m L，水解時(shí)間為4h，不同溫度情況下脫去豆粕中磷量如圖5所示。
由圖5可知，磷釋放量隨溫度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)溫度達(dá)到50 0C時(shí)對(duì)豆粕的脫磷效果最好，脫磷量達(dá)到3.724 mg/g。在37 0C（人體溫度）時(shí)，植酸酶的脫磷效果不是最好，若要更好的利用磷，應(yīng)在動(dòng)物進(jìn)食之前以高于動(dòng)物體溫的酶液浸泡飼料（豆粕等）。另外，溫度太高也會(huì)使酶失去活性，所以也不適宜將酶加入較高溫度的水中。
2.1.4不同pH對(duì)無機(jī)磷含量的影響
在酶加量為600 U/g，底物濃度為60 mg/m L，溫度為50℃，水解時(shí)間為4h，不同pH時(shí)脫去豆粕中磷量如圖6所示。
由圖6可知，磷釋放量隨pH增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)pH 5時(shí)植酸酶脫磷效果最好，脫磷達(dá)到3.495 mg/g。隨著pH的增加，pH過高過低，植酸酶會(huì)變性，因此其酶活會(huì)呈先上升后下降的的趨勢(shì)。植酸酶的酶活直接決定酶解豆粕中植酸的能力，所以磷釋放量是隨pH的上升呈先上升后下降。
2.2正交試驗(yàn)確定脫磷作用的最優(yōu)條件
結(jié)合前面的單因素試驗(yàn)得到的結(jié)論，分別選取不同粗酶液加量、底物濃度、pH和溫度為影響因素，進(jìn)行L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)。
表1表明黑曲霉植酸酶水解豆粕中植酸4個(gè)因素中，影響程度大小依次為D、B、A和C，最優(yōu)組合為A2B2C1D3；而正交試驗(yàn)組合中植酸酶水解植酸能力最好的為A3B2C1D3，故需進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)以確定最優(yōu)組合。
比較A2B2C1D3和A3B2C1D3兩種條件下的脫磷效果。試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果如表2所示。
由表2驗(yàn)證試驗(yàn)可得，當(dāng)酶加量為600 U/g，底物濃度為60 mg/m L，pH 4，溫度為55 0C時(shí)，即組合A3B2C1D3，植酸酶有最優(yōu)的脫磷作用，此時(shí)脫去無機(jī)磷的量為4.127 mg/g。
2.3最優(yōu)條件下考察磷釋放量隨時(shí)間的關(guān)系
分別用酶液和水浸泡豆粕考察磷釋放隨時(shí)間的變化情況，其結(jié)果見圖7所示。
由圖7可以看出，常溫水浸泡豆粕無機(jī)磷的釋放量幾乎不變，平均為0.51 mg/g。當(dāng)酶液浸泡時(shí)間達(dá)5h，磷釋放量將不會(huì)明顯增加。磷釋放量隨時(shí)間的增加呈先上升后平穩(wěn)的趨勢(shì)。隨時(shí)間的增加，豆粕中植酸磷不斷被水解出來，最后所有磷全被水解出來，最大水解磷量為4.187 mg/g。
試驗(yàn)測(cè)得豆粕中總磷、無機(jī)磷和植酸磷的數(shù)據(jù)如表3所示。
所以5h豆粕中植酸的水解率為：(4.187-0.51)／4.21×100%=87.34%。豆粕中植酸磷與總磷的比例達(dá)到67%，通過水解無機(jī)磷總量將從33%提高到90%以上，在動(dòng)物飼料中加入植酸酶有利于動(dòng)物對(duì)磷的吸收。
3結(jié)論
試驗(yàn)利用誘變選育得到的高產(chǎn)植酸酶黑曲霉菌株發(fā)酵得到的植酸酶粗酶液水解豆粕中的植酸，研究其脫磷的最佳作用條件。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，得到植酸酶水解豆粕中植酸的最優(yōu)條件為：酶加量為160 U，底物濃度為60 mg/m L，pH為4，溫度為55℃。在反應(yīng)5h以后無機(jī)磷的量相對(duì)于水浸泡所得磷增加較多。試驗(yàn)測(cè)得植酸磷含量為4.21 mg/g，最優(yōu)條件下豆粕中植酸酶的水解率為87.34%。
為了進(jìn)一步提高植酸酶的產(chǎn)量，可以采用基因工程菌的方法，同時(shí)為了避免飼料制粒過程中的高溫對(duì)酶活的不利影響，下一步可對(duì)黑曲霉菌株進(jìn)行遺傳改良，增強(qiáng)對(duì)熱的耐受性，進(jìn)一步拓寬其應(yīng)用范圍。
