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王立娟1，胡萍萍2

1．商丘醫(yī)學(xué)高等�？茖W(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河南商丘476100;2．重慶大學(xué)創(chuàng)新藥物研究中心，重慶400044

[摘要]  目的：研究細(xì)胞型朊蛋白( P r Pc)有無抑菌活性。方法：把P r Pc分別與金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、大腸桿菌等5種菌孵育一定時(shí)間，然后用碘化丙錠對上述5種樣品染色后采用流式細(xì)胞儀檢測各樣品的熒光信號。結(jié)果：通過對流式細(xì)胞儀的熒光信號進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)P r P c對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌具有明顯的抑制活性，而另外3種菌的樣品沒有檢測到熒光信號的增強(qiáng)，亦即P r Pc對這3種菌無抑菌活性。結(jié)論：細(xì)胞型朊蛋白有一定的抑菌活性，有望成為一種新型的抗菌肽。

[關(guān)鍵詞]  細(xì)胞型朊蛋白；抑菌活性；抗菌肽；熒光信號

[中圖分類號]  Q93-33; R915[文章編號]  1009-0002(2016)02-0257-03

 抗生素的出現(xiàn)極大地降低了感染性疾病的死亡率，給人類做出了巨大貢獻(xiàn)。但是抗生素的不合理使用使得微生物的耐藥性變得相當(dāng)嚴(yán)重，而且還出現(xiàn)了超級細(xì)菌。近年來在抗生素的開發(fā)方面并沒有取得很大進(jìn)展，所以在感染性疾病的治療方面，人類重新面臨很大的壓力和挑戰(zhàn)。針對這一問題，科學(xué)家正在進(jìn)行辛勤不懈的探索，試圖找出對策或新的治療藥物。

 Bomanl21于1975年從惜古比天蠶（Hyalophoracecropia）中誘導(dǎo)出具有抗菌活性的小分子肽，這種物質(zhì)可以抑制細(xì)菌的生長，被稱為抗菌肽。除了抑制細(xì)菌外，抗菌肽還可以抑制病毒、真菌、寄生蟲，對腫瘤細(xì)胞也有作用，所以抗菌肽的發(fā)現(xiàn)給人類感染性疾病的治療帶來了新的希望。抗菌肽在自然界中廣泛存在，很多生物都能產(chǎn)生，迄今，在微生物、昆蟲、無脊椎動物、植物、鳥類、兩棲類、魚、哺乳動物（包括人類）等的體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種抗菌肽。通�？咕�肽分子很小，含有12～100個(gè)氨基酸殘基，一般帶2～9個(gè)正電荷，是兩性分子。由于抗菌肽具有廣譜、高效的殺菌作用，且不易產(chǎn)生耐藥和交叉抗性，有望成為可替代抗生素的一類新型藥物。

 細(xì)胞型朊蛋白(cellular prion protein，P r Pc)是細(xì)胞內(nèi)正常存在的非傳染性糖蛋白，相對分子質(zhì)量只有33x103~35x103，包括一個(gè)靈活的N端區(qū)域，以及由3個(gè)a螺旋、1個(gè)短的雙鏈反平行B片層結(jié)構(gòu)組成的球形C端區(qū)域。南于P r P c是小分子肽，也是兩性分子，所以和抗菌肽的某些特征類似，可能具有抗菌肽類似的抗菌活性。闡明P r P c的生理功能，對人和

動物的傳染性海綿樣腦病的治療也有重要意義。到目前為止，對于P r Pc的生理功能唷較多看法，比如細(xì)胞攝取或與銅離子結(jié)合、抗細(xì)胞凋亡和抗氧化作用、參與造血干細(xì)胞的更新、跨膜信號傳導(dǎo)、形成和維持神經(jīng)突觸、與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附等；此外，還發(fā)現(xiàn)它與腫瘤關(guān)系密切，但并沒有關(guān)于它有抑菌活性的報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中，我們利用流式細(xì)胞術(shù)對Pr Pc的抑菌活性進(jìn)行了初步研究，這對于進(jìn)一步探索其生理功能、研究其與傳染性海綿樣腦病的關(guān)系，

以及開發(fā)抗菌肽都有很重要的意義。

1  材料和方法

1.1材料

 金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、巨大芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌、大腸桿菌BL-21由西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供；營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基、LB同體培養(yǎng)基（自制）；碘化丙錠(propidium iodide，PI)（Sigma公司）；3010 uv -vis分光光度計(jì)（日立公司）；EPICSXL流式細(xì)胞儀（貝克曼庫爾特有限公司）。

1.2細(xì)胞型朊蛋白的分離純化

 在LB培養(yǎng)基（含有卡那霉素）上接種大腸桿菌BL-21（攜帶可表達(dá)Pr Pc的基因），37C過夜培養(yǎng)，挑單菌落接種于2.5 m L含1%0卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，置220 r/min搖床中37。C培養(yǎng)過夜，次日上午將該2.5 m L菌液接種在含l%�？�那霉素的250m L 2xYT液體培養(yǎng)基中，置220 r/min搖床中37℃培養(yǎng)，當(dāng)菌液D600nm值為0.6～1.0時(shí)加l%0 IPTG誘導(dǎo)，

繼續(xù)在搖床中培養(yǎng)6h左右，離心菌液，將沉淀重懸于60 m L裂解液中，超聲波破碎至菌液澄清，再離心收集含有朊蛋白的沉淀，用50 m L裂解緩沖液加2mol/L Na Cl、5%  Triton  X- 100和裂解緩沖液加2mol/L尿素各洗滌一次，每次洗滌經(jīng)磁力攪拌20 min后于12 000 r/min離心15 min；留樣做SDS-PAGE檢驗(yàn)；下層用變性緩沖液懸浮，4cC攪拌過夜使蛋白質(zhì)充分變性，然后離心去除沉淀，上清液過Ni柱，上樣完成后用復(fù)性緩沖按濃度遞減的順序使蛋白質(zhì)復(fù)性，用洗脫緩沖液把朊蛋白從Ni柱上洗脫下來，經(jīng)SDS-PAGE檢測，并用Bradford蛋白質(zhì)試劑盒定量。

1.3抑菌活性實(shí)驗(yàn)

 在LB平板E劃線活化各菌，分別挑單菌落于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在220r/min、370C搖床中培養(yǎng)過夜，4000 r/min離心5 min收集菌體，將各菌濃度調(diào)為0.5 McFarland Standard，再將P r Pc與各菌于370C孵育30 min，各樣品用15μL 1mg/m L碘化丙錠室溫環(huán)境下避光染色15 min，上流式細(xì)胞儀檢測。

2結(jié)果

2.1  細(xì)胞型朊蛋白與金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌的作用情況

 圖1是P r Pc分別與金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌作用情況的熒光圖。橫坐標(biāo)表示樣品的熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù)目。P r Pc與金黃色葡萄球菌相互作用一定時(shí)間，PI占84.94%，而陰性對照的PI占29.76%。從數(shù)據(jù)和圖均可明顯看出被P r Pc作用過的樣品的熒光強(qiáng)度比陰性對照要強(qiáng)，這問接說明金黃色葡萄球菌被P r Pc作用后受到了損害，使原本不能進(jìn)入活細(xì)胞的染料PI進(jìn)入了細(xì)菌體內(nèi)，并與DNA結(jié)合，從而產(chǎn)生了熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)，證明 P r Pc對金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用。圖1B示P r Pc與枯草芽胞桿菌相互作用的結(jié)果，被P r Pc作用過的枯草芽胞桿菌樣品的PI為49.94%，陰性對照的PI為14.40%。從數(shù)據(jù)和圖均可明顯看出被P r Pc作用過的樣品的熒光強(qiáng)度比陰性對照強(qiáng)，同樣說明P r Pc與枯草芽胞桿菌發(fā)生了作用，使枯草芽胞桿菌受到了損害，因此P r Pc對枯草芽胞桿菌也有抑制作用。

2.2細(xì)胞型朊蛋白與另外3種細(xì)菌的作用情況

 同樣，隨機(jī)試驗(yàn)了P r Pc對另外3種細(xì)菌，即巨大芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌和大腸桿菌BL-21的作用情況，結(jié)果如圖2所示。各菌與P r Pc作用后樣品的熒光強(qiáng)度與陰性對照相比基本上沒有變化，由此推測，P r Pc對巨大芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌和大腸桿菌BL-21沒有抑菌作用，所以樣品被P r Pc作用后用PI染色沒有檢測到熒光信號的增強(qiáng)。

3討論

 實(shí)驗(yàn)所用染料PI是一種不透膜染料，即當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞膜完整時(shí)PI不能進(jìn)入細(xì)胞；只有當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞膜破損，該染料才可進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞，并與核酸結(jié)合，從而造成熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，熒光信號可用流式細(xì)胞儀檢測。我們用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞型朊蛋白的抑菌活性進(jìn)行了初步探索。通過P r Pc與各細(xì)菌作用后熒光強(qiáng)度的變化，可以初步判斷P r Pc是否對該細(xì)菌有抑制殺傷作用。我們隨機(jī)試驗(yàn)了5種菌，發(fā)現(xiàn)P r Pc對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有明顯的抑制作用，而對另外蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和大腸桿菌BL-21沒有抑制作用。由此可見，P r Pc有一定的抑菌活性，可能是一種潛在的抗菌肽，但其抗菌選擇性和抗菌機(jī)制尚須進(jìn)一步研究確認(rèn)。

 到目前為止，現(xiàn)有抗菌肽的作用機(jī)制還沒有完全闡明，仍然存在爭議。但是，不管抗菌肽的具體作用機(jī)制如何，它們的活性幾乎大都依賴于與細(xì)菌細(xì)胞表面的相互作用，因抗菌肽大都帶有2～9個(gè)正電荷，所以帶正電荷的抗菌肽首先與細(xì)菌細(xì)胞表面的帶負(fù)電荷的成分，如G菌細(xì)胞壁上脂多糖中的磷酸基團(tuán)，或G+菌細(xì)胞壁上的磷壁酸以靜電相結(jié)合。因此，P r Pc對不同細(xì)菌所具有的不同抑菌活性可能與細(xì)菌細(xì)胞表面所帶基團(tuán)有關(guān)，或與芽胞桿菌的不同抗逆性有關(guān)，這還有待深入探討。