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 鄭陽1 ，2，許秀麗1，楊丙成2，李紹輝1，張元1，張峰1*

 1．中國檢驗檢疫科學(xué)研究院食品安全研究所(北京100123)；2．華東理工大學(xué)藥學(xué)院(上海200237)

摘要香豆素作為一種常見的食品添加劑，長期服用或接觸將會引起過敏、腸胃不適等不良反應(yīng)，危害人類健康，因此檢測香豆素類化合物用量具有重要的意義。闡述了香豆素的研究背景和現(xiàn)狀，就近些年來國內(nèi)外食品中香豆素類化合物的前處理方法及檢測方法的研究現(xiàn)狀進行了綜述，并比較了不同前處理方法的優(yōu)缺點，旨在為食品中香豆素類化合物的監(jiān)控提供參考。

關(guān)鍵詞  香豆素；危害；食品；分析方法

  香豆素，又名苯并a-吡喃酮，其母體為苯環(huán)與氧雜環(huán)并合成的雙環(huán)化合物。香豆素類物質(zhì)主要存在于蕓香科、傘形科和菊科等高等植物中，在動物及微生物代謝產(chǎn)物中也有存在。根據(jù)其結(jié)構(gòu)可分為簡單香豆素類（如6-甲基香豆素）、呋喃香豆素類（如補骨脂素）、吡喃香豆素類（如花椒內(nèi)酯）和其它香豆素類（如蛇床子素）等。由于香豆素有定香與提升香氣的作用，作為香味添加劑廣泛地應(yīng)用于食品中。

 早在1900年以前，國外文獻已有關(guān)于香豆素毒性問題的報道。香豆素主要會致動物的長期昏迷或死亡，常見的癥狀是肝退化與壞死、血管變化與海綿狀血管瘤等。隨著科技手段的不斷進步，人們對香豆素毒性的研究日益深入。經(jīng)研究表明，香豆素類物質(zhì)的毒性來自于其母體的化學(xué)結(jié)構(gòu)，見圖1。母體中氧原子由于耦合雙鍵的作用而具有較強的活動性，容易在體內(nèi)引發(fā)產(chǎn)生氧自由基，破壞機體，對肝腎產(chǎn)生中等毒性，從而危害人類健康。

 許多國家地區(qū)及相關(guān)機構(gòu)對食品中香豆素含量進行了規(guī)定，具體見表1。

 基于國際上對香豆素類化合物毒副問題的日益關(guān)注，建立準(zhǔn)確快速簡便的香豆素分析檢測方法對于評估食品安全性有著重要作用。就近年來國內(nèi)外文獻報道的食品中香豆素類物質(zhì)前處理及檢測方法進行了簡要的總結(jié)。

1  香豆素類化合物前處理方法

  建立復(fù)雜基質(zhì)中香豆素的檢測方法，前處理是非常重要的一個環(huán)節(jié)。前處理不僅要最大限度地提取目標(biāo)物，還要最大程度減少雜質(zhì)的量，降低基質(zhì)干擾。目前針對食品中香豆素物質(zhì)的前處理方法有傳統(tǒng)方法例如液液萃取( Liquid-liquid extraction,  LLE) 、新型前處理技術(shù)(如分散液一液微萃取( Dispersiveliquid-liquid microextraction,  DLLME))、固相萃取( Solid-phase extraction,  SPE)、超臨界流體萃取( Supercritical fluid extraction,  SFE)、基質(zhì)分散固相萃取( Matrix solid-phase dispersion,  MSPD)和加壓溶劑萃取( Pressurized liquid extraction,  PLE)等。

各種前處理方法優(yōu)缺點見表2。

1.1液-液萃取

  液-液萃取( LLE)是目前應(yīng)用較多的前處理方法，該方法采用甲醇等有機溶劑或甲醇一水等混合溶劑進行提取，離心后過膜即可上機檢測。

 陳捷等采用無水乙醚萃取含油脂的固體樣品、不含油脂的固體樣品和飲料酒類等液體中的香豆素，此方法萃取效果較好，但乙醚所需量較大，樣品處理稍顯繁瑣。

 分散液一液微萃取( DLLME)是在液-液萃取基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型樣品前處理技術(shù)。該方法首先在樣品溶液中加入數(shù)十微升的萃取劑和一定體積的分散劑，混合液經(jīng)輕輕振蕩后形成一個水／分散劑／萃取劑的乳濁液體系，再經(jīng)離心分層，用微量進樣器取出萃取劑直接進樣分析。

 朱曉蘭等建立了煙用添加劑中香豆素等8種有害物的DLLME提取、凈化方法，并對液-液分散微萃取溶劑及其體積、分散劑及其體積和萃取時間等條件進行了優(yōu)化，最終選擇70 μL氯仿作為萃取劑，0.5mL甲醇作為分散劑，萃取時間為3 min。富集倍數(shù)為140～208倍，該方法的加標(biāo)回收率為90%～l00%，與行業(yè)推薦的測定方法相比，該方法具有富集效果好、回收率高等優(yōu)點。

1.2固相萃取

 固相萃取( SPE)是近年發(fā)展起來一種樣品預(yù)處理技術(shù)，由液-固萃取和柱液相色譜技術(shù)相結(jié)合發(fā)展而來，主要用于樣品的分離、純化和濃縮。

 韓超等考察了3個SPE柱(Superclean ENVI C18、Waters Oasis HLB和Waters Oasis MAX)對奶粉樣品的凈化效果，并比較了各固相萃取吸附劑的萃取效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Waters Oasis HLB SPE柱的凈化處理效果較好，其加標(biāo)回收率為85.2%~107.4%，基本滿足要求。具體操作：用5 m L甲醇和水平衡活化固定相，以甲醇-水(1:9，V/V)作為淋洗液，隨后采用6 m L甲醇作為洗脫液，將4種香料洗脫完全，其中香豆素的定量限為5.0μg/kg，口]應(yīng)用于嬰幼兒奶粉中香料檢測。

 固相微萃取( Solid-phase microextraction，SPME)是在固相萃取基礎(chǔ)發(fā)展的一種處理技術(shù)，其關(guān)鍵在于選擇石英纖維上的涂層（吸附劑），要使目標(biāo)化合物能吸附在涂層上，而干擾物與溶劑不吸附，一般目標(biāo)化合物是非極性即選用非極性涂層，極性時選擇極性涂層。

 據(jù)了解，目前并未有利用SPME測定食品中香豆素的文獻報道，多數(shù)報道為利用SPME測定其他香味成分。Clark等在運用SPME分析煙草中增香劑時，對四種不同規(guī)格及材料（100μm甲基硅膠、65μm聚丙烯酸酯、65I_Lm甲基硅膠／二乙烯基苯及65μm聚乙二醇／二乙烯基苯）的萃取頭進行了考察，試驗結(jié)果表明，65 μm聚乙二醇／二乙烯基苯萃取頭對煙草中香氣物質(zhì)的萃取效果最好，這是由于其具有中等極性，對極性和非極性物質(zhì)都有較好的吸附效果。

1.3基質(zhì)固相分散萃取

 基質(zhì)固相分散萃取( MSPD)原理是將涂有C18等多種聚合物的固相萃取材料與樣品一起研磨，得到半干狀態(tài)的混合物并將其填料裝柱，然后用不同的溶劑淋洗柱子，將待測物淋洗下來。

 Anna等將基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)應(yīng)用于分析獨活中呋喃香豆素成分的檢測中來，并對MSPD條件進行了優(yōu)化。具體操作步驟：0.25 g樣品與0.5 g C18分散劑混合，用不同的溶劑（石油醚、二氯甲烷等）萃取，其中80%甲醇和石油醚／甲醇（50：50，V:V）對香豆素的提取效果最好，基質(zhì)分散固相萃取柱經(jīng)5 m L 80%甲醇洗脫后，提取物進HPLC進行分析。

1.4加壓溶劑萃取(PLE)

 加壓溶劑萃取是在較高溫度( 50℃～200℃)和壓力(1 000～3 000 psi)下用有機溶劑萃取固體或半固體的自動化方法。

 Vierikova等采用了加壓溶劑萃取技術(shù)，以二氯甲烷為萃取劑，萃取液使用凝膠滲透色譜凈化，測定各種食品中香豆素殘留的方法，該方法的檢出限和定量限分別為20 μg/kg和50μ g/kg，滿足試驗要求。

1.5超臨界流體萃取

 超臨界流體萃取( SFE)是在超臨界狀態(tài)下，將超臨界流體與待分離的物質(zhì)接觸，使其有選擇性地依次把極性大小、沸點高低和相對分子質(zhì)量大小不同的成分萃取出來。

 Eila等建立了芹菜中光毒性呋喃香豆素類化合物的分析方法。該方法優(yōu)化了SFE條件，在20 M Pa、80℃、CO2密度0.587 g/m L下提取效率最高，回收率均在90%以上。該方法同樣適用于其他蔬菜中呋喃香豆素的測定。

2香豆素類化合物檢測技術(shù)

2.1高效液相色譜法(HPLC)

 在香豆素類物質(zhì)的檢測中，高效液相色譜應(yīng)用最為廣泛，常配以二極管陣列檢測器( DAD)或紫外檢測器(UV)，選擇合適的色譜柱、流動相及檢測波長，是實現(xiàn)分離的關(guān)鍵因素。目前在檢測香豆素時廣泛使用的是反相C18柱。

 流動相一般選擇甲醇、乙腈、水和冰醋酸等，針對不同的物質(zhì)選擇不同配比的流動相。席海為等建立了一種同時測試都梁滴丸中5-甲基補骨脂素、歐前胡素和異歐前胡素含量的HPLC-UV方法。三種物質(zhì)的檢測波長依次為320，254和254 nm。三種物質(zhì)的RSD分別為2.89%，0.31%和2.45%，適用于藥品的檢驗工作。

2.2液相色譜質(zhì)譜法(HPLC-MS)

 在單純高效液相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，被認(rèn)為是目前效果最好的分析手段，質(zhì)譜由于靈敏度和選擇性高于其他檢測器，因而可以分析更多的物質(zhì)，在使用此法的研究報告中，香豆素都是作為復(fù)雜混合物的一個或幾個組分被檢出的。但需要注意的是，液相色譜與質(zhì)譜的接口不容易實現(xiàn)順利對接，必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)娜軇�揮發(fā)過程，這在一定程度上限制了可分析物質(zhì)的種類。

 Ahn等建立了同時測定朝鮮當(dāng)歸根中9種香豆素成分的HPLC-DAD/MS方法。該方法比較了不同色譜柱對9種香豆素分離能力的大小，試驗結(jié)果證明Capcell Pak C18 UG 120( 250 mm×4.5 mm,5μm)分離效果最好，9種香豆素在0.2～250 μg/m L表現(xiàn)出良好

的線性關(guān)系，R2在0.998～0.999之間。該方法重點研究了朝鮮當(dāng)歸中香豆素化合物的特征，可用以朝鮮當(dāng)歸的質(zhì)量控制，并區(qū)分不同產(chǎn)地。

 Raters等報道了了LC-MS/MS測定混合調(diào)味料、肉桂餅干等在內(nèi)的500種食品中香豆素的檢測方法。該方法使用d4-香豆素作為內(nèi)標(biāo)物定量，檢出限和定量限分別為0.03 mg/kg和0.05 mg/kg，選擇性和靈敏度比HPLC-UV法高出100倍。

2.3  氣相色譜質(zhì)譜法(GC-MS)

 氣相色譜是一種對易于揮發(fā)而不發(fā)生分解的化合物進行分離與分析的色譜技術(shù)，主要是利用物質(zhì)的沸點、極性及吸附性質(zhì)的差異來實現(xiàn)混合物的分離。香豆素物質(zhì)具有揮發(fā)性，能夠在氣相條件下實現(xiàn)分離。

 李長于等采用GC-MS/MS測定香精香料中香豆素含量，以丙酸苯乙酯為內(nèi)標(biāo)進行定量，檢出限為40μg/kg。MS/MS排除干擾能力強，定量是本底值低，適用于香精香料或其他食品添加劑等輔助樣品中香豆素快速檢測。

 吳惠勤等用GC-MS測定了煙用香精中香豆素含量。該方法使用DB-1MS色譜柱，用色譜保留時間、質(zhì)譜特征離子同時定性，消除了香精樣品中復(fù)雜基體的干擾，避免了假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。檢出限為0.1 mg/kg，能夠滿足煙用香精中香豆素物質(zhì)的檢測。

2.4  毛細(xì)管電泳法(Capillary electrophoresis，CE)

 毛細(xì)管電泳是一類以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動力的新型液相分離技術(shù)。目前該技術(shù)在分析香豆素物質(zhì)的應(yīng)用較少，但已報道的方法均能很好地滿足定量要求，是一種具有潛力的檢測方法。

 邱涵等采用毛細(xì)管電泳法測定了克炎腫片中香豆素的含量。電泳緩沖液為25 m mol/L的硼砂-硼酸液（pH為9.2），內(nèi)含30 m mol/L的十二烷基磺酸鈉和10%乙腈，運行電壓為20 kV，檢測波長為214 nm。其中香豆素的線性范圍為25～125μg/m L，RSD為2.0%�？蓾M足試驗要求。

3結(jié)語

 目前針對香豆素類化合物的前處理方法多是液一液萃取，而一些新興的前處理方法不僅能夠提高分析選擇性和靈敏度，還可以減少對環(huán)境和人體的危害，但由于某些設(shè)備價格較為昂貴，運行和維護成本較高，因此降低成本是該方法是否能夠普及的關(guān)鍵。檢測方法以HPLC-MS、GC-MS為主，這是由于該方法能夠更好地滿足定性定量要求。雖然香豆素類成分在某些行業(yè)已被禁用，但經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，香豆素在食品行業(yè)應(yīng)用仍十分廣泛，這在一定程度上對人類健康存在潛在的威脅，因此建立香豆素類化合物的分析方法對于產(chǎn)品質(zhì)量控制及應(yīng)對國內(nèi)外不斷變化的產(chǎn)品質(zhì)量法規(guī)有著十分重要的意義。