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 孫鵬1，2，李貴節(jié)1，2，朱凱1，王睿1， 2*

1．重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系（重慶400067）；2．重慶第二師范學(xué)院功能性生態(tài)食品研究所(重慶400067)

摘要研究了高效液相色譜法(HPLC法)檢測夏桑菊涼荼中綠原酸、迷迭香酸、木犀草苷、蘆丁、槲皮素和蒙花苷含量的方法。色譜條件為：依利特C．。色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，甲醇-0.1%乙酸鈉水溶液(乙酸調(diào)至pH 3.0)梯度洗脫，流速1mL/min，檢測波長350mn，柱溫40℃。結(jié)果表明：6種活性成分的分離度良好，線性范圍分 別0.03～100，0.04～3.125，0.04～124，0.06～2.88，0.01～28和0.37～19 μg/m L，檢測限分別為0.19，0.26，0.24，0.38，0.078和2.2μg/g，定量限分別為0.62，0.88，0.80，1.24，0.26和7.4μg/g，平均回收率在99.4%~101.5%之間，精密度RSD分別為0.25%， 0．18%，0.49%0，0.84%，0.92%0和2.30%。該方法專屬性強，精密度好，可用于夏桑菊涼茶中綠原酸、迷迭香酸、木犀草苷、蘆丁、槲皮素和蒙花苷等物質(zhì)的定量測定，并可應(yīng)用于夏桑菊涼茶產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

  關(guān)鍵詞  HPLC;夏桑菊；涼茶；含量

 “夏桑菊”源自清代著名溫病學(xué)家吳鞠通《溫病條辨》的經(jīng)典名方“桑菊飲，主要由夏枯草、桑葉和菊花配伍而成，具有清肝明目、疏風(fēng)散熱、除濕痹和解瘡毒等功效，用于風(fēng)熱感冒、目赤頭痛、頭暈耳鳴、咽喉腫痛和疔瘡腫毒等癥，并可作清涼飲料使用。

 近幾年，涼茶飲料在市場上熱銷，越來越多的企業(yè)開始關(guān)注這個新興的飲料市場，涼茶新產(chǎn)品不斷出現(xiàn)在市場上。  “夏桑菊”作為傳統(tǒng)名方，2006年開始出現(xiàn)在飲料市場上，截至目前已有多家企業(yè)生產(chǎn)“夏桑菊”涼茶飲料。據(jù)調(diào)查，2013年全國涼茶總銷售額超過300億元，占國內(nèi)飲料市場份額的20%以上。然而，與涼茶飲料的熱銷形成鮮明對比的，則

是目前我國對于涼茶類飲料的國家標(biāo)準(zhǔn)還不夠完善，僅有一些地方標(biāo)準(zhǔn)或企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。這些標(biāo)準(zhǔn)雖然對涼茶中添加的中藥材種類有所規(guī)定，但對其含量以及功效卻甚少涉及。

 夏枯草是夏桑菊中的君藥，主要活性成分有迷迭香酸、木犀草苷、蘆丁和槲皮素等，《中國藥典》中以迷迭香酸為夏枯草的指標(biāo)性成分。桑葉中的主要活性成分有綠原酸、蘆丁和槲皮素等，《中國藥典》中將蘆丁作為桑葉的指標(biāo)性成分。菊花中的主要活性成分有綠原酸、木犀草苷和蒙花苷等，《中國藥典》中綠原酸和木犀草苷為菊花的指標(biāo)性成分。試驗收集到了市場銷售的8種夏桑菊涼茶飲料，結(jié)合《中國藥典》對夏枯草、桑葉和菊花的指標(biāo)性成分要求，以及上述3種藥材活性成分的文獻報道，對夏桑菊涼茶中的綠原酸、迷迭香酸、木犀草苷、蘆丁、槲皮素和蒙花苷6種活性成分進行了定量分析，以期為夏桑菊涼茶的質(zhì)量控制提供有價值的參考。

1  儀器、設(shè)備與試劑

 Agilent 1260高效液相色譜儀（四元梯度泵，紫外檢測器，Open LAB色譜工作站）：美國Agilent公司；FA2004分析天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；DZF6050真空干燥箱：蘇州江東精密儀器有限公司；RE-5286臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；KQ5200超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

 綠原酸、迷迭香酸、木犀草苷、蘆丁、槲皮素、蒙花苷對照品：上海金穗生物科技有限公司；甲醇（色譜純）：美國Honeywell公司；乙酸鈉、乙酸等均為分析純：重慶博藝化學(xué)試劑有限公司；水為自制重蒸水。

 夏桑菊涼茶樣品：市售，產(chǎn)自重慶、四川、廣東和廣西等地。

2方法與結(jié)果

2.1對照品溶液的制備

 稱取在25℃減壓干燥12 h的綠原酸、迷迭香酸、木犀草苷、蘆丁和槲皮素對照品5 mg，精確至0.01mg，置于50 m L容量瓶中，加甲醇適量，振搖使其溶解，繼續(xù)用甲醇稀釋至刻度；蒙花苷對照品5 mg，精密稱定，置100 m L容量瓶中，用50%甲醇水溶液溶解并定容。用上述方法制得對照品儲備液，將儲備液置于4℃避光保存。

 精密量取綠原酸、迷迭香酸、木犀草苷、蘆丁和槲皮素對照品儲備液各1mL，蒙花苷對照品儲備液2mL，置10 m L容量瓶中，加甲醇定容，即得混合對照品溶液。

2.2供試品溶液的制備

 收集市售的8種夏桑菊涼茶，分別編號為A，B，C，D，E，F(xiàn)，G和H。其中A~G為固體飲料（顆粒劑），H為液體預(yù)包裝飲料。

 固體樣品處理：稱取樣品2.5 g，精確至0.1 mg，置容量瓶中，加入質(zhì)量分數(shù)50%甲醇水溶液50 m L，稱定質(zhì)量，室溫下超聲30 min(功率250 W，頻率40kHz)，取出，靜置至室溫，補足質(zhì)量，搖勻，4 000r/min離心5 min，倒出上清液，用0.45μm微孔濾膜過濾，即得。

 液體樣品處理：取樣品適量，4 000 r/min離心5mm，倒出上清液，用0.45μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3  色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

 色譜柱：依利特C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm)；流速：1 m L/min；進樣量：20 VL；柱溫40℃；采集時間35 min；流動相：A為甲醇，B為0.1%乙酸鈉水溶液（乙酸調(diào)至pH 3.0）；通過比較330，340，350和360 nm等多個檢測波長，發(fā)現(xiàn)在350 nm波長條件下6種成分的吸光度均比較理想，因此將350nm選作檢測波長。梯度洗脫條件見表1；

  在該色譜條件下，混合對照品和樣品的色譜圖見圖1。

  該色譜條件下，對稱因子、塔板數(shù)和分離度等系統(tǒng)適用性試驗結(jié)果見表2。

2.4檢測限和定量限

 將一系列已知濃度的對照品進行分析，通過考察圖譜在一段時間（圖譜中平坦的時間段）的噪音，分別以信噪比RSN=3和RSN=10時各對照品的量作為檢測限和定量限。上述檢測限和定量限乘以方法稀釋倍數(shù)除以樣品稱樣量，得該方法的檢測限和定量限見表3。

2.5線性范圍

 精密量取由2.1方法制備的對照品儲備液適量，用甲醇稀釋成系列濃度，以2.3的方法進行試驗，并記錄峰面積。以對照品質(zhì)量濃度X（μg/m L）為橫坐標(biāo)，峰面積y為縱坐標(biāo)進行線性回歸分析，線性范圍、回歸方程以及相關(guān)系數(shù)見表4。

2.6精密度試驗

 取由2.1方法制備的混合對照品溶液，照2.3項下色譜條件，樣品平行測定6次，所得綠原酸、迷迭香酸、木犀草苷、蘆丁、槲皮素和蒙花苷峰面積的RSD分別為0.25%，0.18%，0.49%，0.84%，0.92%和2.3%。結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.7加樣回收試驗

 精密量取2.2項下已知含量的夏桑菊涼茶樣品10mL共9份，分3組，分別精密添加2.1項下混合對照品溶液4，5和6 m L，加甲醇稀釋至20 m L，照2.3項下色譜條件進行測定，記錄色譜峰面積，計算回收率。結(jié)果如表5所示，表明該檢測方法具有良好的回收率。

2.8樣品測定

 每種樣品各取3份，以2.2的方法制備供試品溶液，照2.3項下色譜條件進行測定，記錄色譜峰面積，并計算樣品中的綠原酸、迷迭香酸、木犀草苷、蘆丁、槲皮素和蒙花苷含量。為方便比較，所有的含量均折算為每份最小包裝樣品（A~G最小包裝均為10g，H最小包裝為350 m L）中所含的成分質(zhì)量，試驗結(jié)果見表6。

3結(jié)論與討論

 在研究文獻報道和已有的國家標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，選取了具有代表性的6種成分作為夏桑菊涼茶多組分質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。通過試驗研究發(fā)現(xiàn)，收集到的產(chǎn)自重慶、四川、廣東和廣西等地的8種市售夏桑菊涼茶飲料中綠原酸、迷迭香酸、木犀草苷、蘆丁、槲皮素和蒙花苷6種成分的含量相差較大。由于綠原酸是3種藥材的共有成分，因此在7種樣品中均有檢測出，其中樣品C檢測出的綠原酸含量低于定量限，樣品D僅檢測出綠原酸一種成分；除了樣品H有槲皮素檢出外，其余樣品均未檢測到該成分；而樣品E則未檢出上述6種成分。由此可見，不同企業(yè)所生產(chǎn)的夏桑菊涼茶飲料，其產(chǎn)品配方存在著較大差異。

 涼茶在現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)中屬植物飲料類中的其他植物飲料，即以符合國家相關(guān)規(guī)定的其他植物原料經(jīng)加工或發(fā)酵制成的飲料。目前，沒有專門針對涼茶的國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。廣東省地方標(biāo)準(zhǔn)《植物飲料（含涼茶）》（征求意見稿）規(guī)定涼茶中添加的中藥材原料應(yīng)符合《中國藥典》、《部頒藥材標(biāo)準(zhǔn)》和《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》的要求，但對于涼茶飲料中活性成分的含量仍然沒有做出定量要求，截至定稿時，該標(biāo)準(zhǔn)仍未正式執(zhí)行。而在2008年發(fā)布的茶飲料國家標(biāo)準(zhǔn)，對各種茶飲料主要活性成分（茶多酚、咖啡因）的含量做出了明確規(guī)定，這在一定程度上確保了原料用茶的比例，保證了茶飲料的產(chǎn)品質(zhì)量。涼茶類飲料標(biāo)準(zhǔn)的欠缺，使得這一類產(chǎn)品的質(zhì)量無法得到有效控制，整個行業(yè)面臨無序發(fā)展的風(fēng)險。

 目前，對于上述6種成分的定量分析，往往需要采取不同的樣品前處理方法和流動相體系。而在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，簡化了樣品前處理過程，對6種待測成分采用梯度洗脫方式，使這些成分在同一色譜條件下能夠有效分離，理論塔板數(shù)和分離度均比較理想。該方法操作簡便，避免了多波長檢測操作繁瑣等難題，精密度、重復(fù)性和回收率均達到定量分析要求，為夏桑菊涼茶飲料的產(chǎn)品質(zhì)量控制提供了可借鑒的試驗方法，具有一定的參考價值。