磁性量子點復(fù)合結(jié)構(gòu)制備及其應(yīng)用分析
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韓雍1，汪慧1，宋曦1，李響2，楊珺1
1．隴東學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院(慶陽745000)；2．南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院(南京210023)
摘要試驗以酶聯(lián)免疫吸附法為檢測基礎(chǔ)，在水相中合成發(fā)光量子點，再由量子點與磁性納米材料相結(jié)合，形成磁性量子點，然后使磁性量子點與羊抗兔IgG聯(lián)結(jié)制備生物熒光探針。該復(fù)合結(jié)構(gòu)物質(zhì)依靠磁性材料的磁富集作用，促進量子點聚集度，增強量子點熒光信號，利用新方法對目標物進行微量檢測，有效地提高了分析測定的靈敏度和穩(wěn)定性。試驗以黃曲霉毒素B1為模式分析物，檢測熒光強度與黃曲霉毒素B1質(zhì)量濃度在0.1～1 000 n g/m L范圍內(nèi)成線性關(guān)系，檢出限為0.1 n g/m L，取得了較滿意的結(jié)果。
關(guān)鍵詞量子點；磁顆粒；黃曲霉毒素B1;酶聯(lián)免疫吸附法
食品安全是當今全世界共同關(guān)注的重大問題，近年來，由食品中各種生物毒素引起的食品安全問題已成為了各國防范和檢測的重點。納米技術(shù)( Nano-technology)是一種涉及領(lǐng)域較為廣泛的現(xiàn)代科學(xué)和現(xiàn)代技術(shù)的結(jié)合物，其中以金納米顆粒、量子點和核殼型熒光納米顆粒為代表的納米粒子在生物芯片、免疫檢測分析、基因突變檢測、遺傳病、腫瘤診斷、藥物研究、食品及環(huán)境中強致病性病原菌的檢測等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，其研究進展和研究成果引人注
目，這將是食品安全檢測技術(shù)發(fā)展的重要方向。黃曲霉毒素B1是對人體傷害最嚴重的生物毒素，而黃曲霉毒素低量治病性，使糧食和食品安全難以進行檢測控制，對其傳統(tǒng)檢測周期長、程序復(fù)雜和所需試劑繁多等缺點已遠遠不能滿足現(xiàn)代檢測要求。納米粒子結(jié)合生物檢測能夠?qū)S曲霉毒素進行高靈敏檢測，但量子點熒光本身信號不穩(wěn)定性使量子點生物檢測具有不可靠特點，因此如何加強量子點熒光信號穩(wěn)定性和信號強度是解決該問題的有效途徑之一。
試驗采用水相合成法制備巰基乙酸包裹的CdTe量子點，通過量子點與磁性納米材料相結(jié)合，再利用磁性納米材料的富集作用，提高熒光信號，并結(jié)合熒光分析方法，建立可靠的黃曲霉毒素Bi的新型高靈敏檢測方法。
1試驗材料
1.1材料與試劑
EDC、NHS: SigmaAldrich；羊抗兔-IgG:生工生物工程有限公司；硼氫化鈉、Fe3O4、FeCl3.6H2O、乙二醇、1，6-己二胺等：國藥集團上�；瘜W(xué)試劑有限公司。
1.2主要儀器與設(shè)備
JEM2100透射電鏡(TEM)：日本JEOL公司；RF5301熒光分光光度計：日本島津；UV2300雙光束紫外可見分光光度計：上海天美科學(xué)儀器有限公司；傅里葉紅外光譜儀：美國Bio-Rad公司；D8 advance型X射線衍射儀：德國布魯克AXS公司；WH-3微型漩渦混合儀：上海滬粵明公司；HYG-Ⅱa回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜：上海欣蕊公司；TGL-16C離心機：上海安亭公司；DF-101S型集熱式磁力加速攪拌器：河南鞏義市予華公司；PYX-DH5-50隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：浙江金壇市精達公司等。
2試驗步驟
2.1磁性納米粒子的制備與表征
磁性納米顆粒（MNPs，F(xiàn)e3O4約25 nm）制備：1，6-己二胺6.5 g，無水醋酸鈉2.0 g，F(xiàn)eCI3. 6H2O 1.0 g，溶于30 m L乙二醇，保持50℃劇烈攪拌約1 h至溶液透明，溶液顏色漸變?yōu)榫萍t色后，轉(zhuǎn)至高壓反應(yīng)釜，198℃條件下保持6h，停止反應(yīng)并冷卻至室溫倒出。用水和乙醇超聲沖洗3次，除去溶劑和未結(jié)合的1，6-己二胺，50℃干燥成粉末，保存待用。
2.2磁性納米粒子與黃曲霉毒素Bi偶聯(lián)抗原（AF Bl-BSA)的結(jié)合及表征
將2.1制成的MNPs 10 mg分散到5 m L的0.01 mol/L的PBS溶液中，并以超聲波處理20 min，加入1.25 m L25%的戊二醛和100 mg的硼氫化鈉，在室溫下震蕩1h，通過外部磁場將MNPs富集，用PBS緩沖液沖洗3次，去除未吸附的戊二醛。接著加入50斗L 1.4 mg/m L
的AFB．-BSA，并在室溫下震蕩6h，通過外部磁場收集反應(yīng)產(chǎn)物，用PBS清洗3次。然后用5 m L 10 mg/m L的BSA溶液進行重懸，室溫下保存6h，以封閉沒有結(jié)合人工抗原的結(jié)合位點。通過外部磁場收集反應(yīng)產(chǎn)物，并以5 m L 0.01 mol/L的PBS重懸，于4℃保存，待用。
2.3復(fù)合結(jié)構(gòu)應(yīng)用分析
對不同濃度的黃曲霉毒素B1進行熒光強度測定，與國標法進行對照，分析試驗建立的檢測方法的準確性和可靠性。同時，將檢測到的熒光強度代入建立好的線性方程，計算回收率以評價該方法的穩(wěn)定性。
3結(jié)果與討論
3.1磁性納米粒子的制備與表征
試驗中制備的磁性納米顆粒經(jīng)超聲波處理后可以在水中均勻分散，形成黑色的懸濁液（如圖1A）。在外加磁場作用下，納米顆�？稍�2 min內(nèi)實現(xiàn)聚集（如圖1B），磁富集作用可以提高量子點分離的效率。
利用TEM和XRD對磁性納米顆粒形貌和組成進行表征。由圖2可知，制備的氨基化磁性納米顆粒粒徑在35～55 nm。由圖3可知，該物質(zhì)屬尖晶石型Fe3O4磁性納米顆粒，峰形符合JCPDS卡75-1610，其窄而強的衍射峰充分說明了磁性納米顆粒具有良好的結(jié)晶性。
由圖4可看出，585 cm-1處的強峰是Fe-O的振動峰。在制備Fe3O4納米顆粒時引入了1，6-己二胺，在1 634 cm-1處為一級胺的N-H剪式振動吸收峰，834 cm-1和1040cm-1處為胺的N-H搖擺振動吸收峰，表明在制備Fe3O4的過程中，顆粒表面已經(jīng)成功包覆了氨基。
3.2磁性納米粒子和人工抗原AFB1-BSA的結(jié)合與表征
氨基化的磁性納米粒子是通過戊二醛與人工抗原AFB1-BSA連接的，由于AFB1-BSA在280 nm以及360nm處有吸收，而磁性納米粒子以及戊二醛在紫外光區(qū)沒有吸收，所以可以用紫外分光光度計來驗證兩者是否已經(jīng)結(jié)合。由圖5所示，在波長280 nm和360 nm處，200μ L人工抗原AFB1-BSA原液紫外吸收和與磁性納米材料結(jié)合富集后上清液紫外吸收相比較有一定差值，這說明有一部分的AFB1-BSA已經(jīng)連接到了磁性納米粒子上。同時，通過熒光顯微鏡對富集物質(zhì)進行觀察，也能夠清晰看到磁性納米材料的復(fù)合體均勻分散（見圖6）。
對比氨基化磁性納米粒子與結(jié)合人工抗原的磁性納米粒子紅外譜圖（圖7）發(fā)現(xiàn)，兩曲線線型基本一致（在圖4中也有同樣表現(xiàn)），1 627 cm-1為一級胺的N-H剪式振動吸收峰，1 540 cm-1為二級胺的N-H吸收峰，可以解釋為磁性納米粒子連接人工抗原AFB1-BSA蛋白質(zhì)一端的N-H吸收峰，表明磁性納米粒子與人工抗原結(jié)合成功。
3.3復(fù)合結(jié)構(gòu)應(yīng)用性能分析
3.3.1 國標法對照測定
將不同質(zhì)量濃度的黃曲霉毒素B1標準溶液( 10-4，10-5，10-6，10-7, 10-8和10-9 g/m L)，分別用國標法和新方法對樣品中黃曲霉毒素B1含量進行檢測，對檢測結(jié)果進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)2種方法檢測到的黃曲霉毒素B1質(zhì)量濃度具有良好的相關(guān)性（如圖8所示），線性方程為IF=0.903 7(AFB1)+0.651 1，R2=0.993 7，檢測范圍5～100 n g/m L，檢出限為5 n g/m L。
在最佳的試驗條件下，測量50 n g/m L標準黃曲霉毒素B1，不同稀釋倍數(shù)下7次，以評估該方法的穩(wěn)定性，熒光強度與黃曲霉毒素AFB1質(zhì)量濃度在稀釋倍數(shù)在1000內(nèi)，即0.1～100 n g/m L下呈良好的線性關(guān)系（圖9~圖10）。回歸方程為IF=-1.333 4(A FB1)+267.75（R2=0.993 6），得到的檢出限為0．1ng/m L，相對標準偏差為3.0%。
3.3.2回收率測定
取市場上銷售的大米，搗碎，加入不同稀釋倍數(shù)的AFB1。稀釋質(zhì)量濃度為10-6～10-9 g/m L，測定熒光強度，并計算回收率�；厥章嗜绫�1所示，回收率89.0%～96.77%，說明試驗所建立的新型檢測技術(shù)的靈敏度和準確性較高，可以用于實際樣品中AFB1的檢測。
4結(jié)論
試驗制備的發(fā)光量子點球形納米顆粒具有很好的分散性和均一性，熒光發(fā)射特征與量子點基本特征保持一致，光穩(wěn)定性得到大幅度提高。量子點納米顆粒與羊抗兔IgG結(jié)合制備熒光納米探針，將人工抗原AFB1-BSA包被于磁性納米材料Fe3O4顆粒上，利用磁性納米材料的磁富集作用，能夠增強熒光信號，使得熒光檢測更加靈敏。制備的生物探針在最佳優(yōu)化條件
下對黃曲霉毒素B1的檢測具有高靈敏、高準確性、高可靠性，其檢測限可達0.1 n g/m L。
