枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕制備抗氧化多肽工藝
相關(guān)鏈接： 中國安全網(wǎng) 中國質(zhì)量網(wǎng) 中國論文網(wǎng) 中國資訊網(wǎng)
柯旭清
貴州輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院(貴陽550025)
摘要 以豆粕為原料，研究枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕制備抗氧化多肽的工藝。通過響應(yīng)面分析法確定枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕制備抗氧化多肽的最佳工藝條件為：接種量3.4%、pH 7.6、發(fā)酵溫度35.4℃和發(fā)酵時間82.1 h。制備出來的抗氧化多肽具有較強(qiáng)的還原能力，高于對照組VC，且具有較強(qiáng)清除OH．的能力，隨著濃度的增加，抗氧化多肽對OH．的清除能力逐漸提高，明顯高于對照組VC。
關(guān)鍵詞豆粕；發(fā)酵；抗氧化多肽；響應(yīng)面
豆粕是大豆榨取豆油后的副產(chǎn)物，一般只用于飼料或者肥料中，利用價(jià)值比較低。但是豆粕中含有豐富蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，蛋白經(jīng)過發(fā)酵、酶解可制備抗氧化多肽。抗氧化多肽具有清除自由基、抗衰老和抗疾病等功能。通過豆粕制備抗氧化多肽，可提高豆粕利用率和商業(yè)價(jià)值。因此，利用響應(yīng)面分析法對枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕制備抗氧化多肽的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并研究得到的抗氧化多肽的抗氧化活性，以期為豆粕資源的綜合開發(fā)利用提供理論參考。
1材料及方法
1.1原料與試劑
豆粕：購于當(dāng)?shù)赜椭邢挢?zé)任公司；枯草芽孢桿菌、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、乙醇、鹽酸溶液、磷酸鈉緩沖溶液、鐵氰化鉀溶液、三氯乙酸、FeCl3溶液、鄰二氮菲溶液、VC等：實(shí)驗(yàn)室提供；DPPH:廣州新暉生物科技有限公司；Dl01大孔吸附樹脂、超濾膜、G-75葡聚糖凝膠：廣州天益化學(xué)試劑有限公司。
1.2儀器與設(shè)備
DS-1電動組織搗碎機(jī)：惠州新光儀器有限公司；UV-4802雙光束紫外可見分光光度計(jì)：廣州尼維儀器有限公司；GT10-1高速離心機(jī)：廣州柏斯特儀器有限公司；真空冷凍干燥機(jī)：深圳啟博儀器有限公司；高壓滅菌鍋：東莞信惠科技有限公司；超凈工作臺：惠州新光儀器有限公司；超濾設(shè)備：廣州柏斯特儀器有限公司等。
1.3試驗(yàn)方法
1.3.1枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕制備抗氧化多肽工藝流程
1.3.1.1抗氧化多肽粗品的制備工藝流程
1.3.1.2抗氧化多肽的分離純化工藝流程
1.3.2枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕制備抗氧化多肽條件的優(yōu)化
通過單因素試驗(yàn)考察接種量、pH、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕制備抗氧化多肽效果的影響，在選取各因素的最優(yōu)試驗(yàn)范圍，采用響應(yīng)面分析法對制備抗氧化多肽條件進(jìn)行優(yōu)化。
1.3.3 DPPH．清除率的測定
取上述抗氧化多肽溶液1.0 m L和5 m L 100 μmol/L的DPPH．溶液加到同一試管，搖勻，黑暗中靜置30mm，測其吸光度。
1.3.4分離純化后的抗氧化多肽還原力的測定
采用普魯士藍(lán)法測定。
取5.0 m L 3.0 mg/m L的上述抗氧化多肽溶液，加入3.0 m L pH 6.5的磷酸鹽緩沖溶液和5.0 m L 3.0%鐵氰化鉀溶液，保溫30 min后，加入5.0 m L 15.0% TCA溶液，混勻，離心。取上清液，加1.0 m L 0.2% FeCl3溶液，定容，700 nm波長處測吸光度。
1.3.5分離純化后的抗氧化多肽羥自由基(OH．)清除能力的測定
采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法測定。
2結(jié)果與分析
2.1 枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕制備抗氧化多肽條件的優(yōu)化
2.1.1接種量對抗氧化多肽制備效果的影響
設(shè)定pH為8，發(fā)酵溫度為35℃，發(fā)酵時間為80 h，分別在接種量為1.5%，2.5%，3.5%，4.5%，5.5%和6.5%六個梯度下，按照1.3.1和1.3.3的方法制備抗氧化多肽并且測其DPPH．清除率。由圖1可以看出，接種量為3.5%時，抗氧化多肽制備效果較好。
2.1.2 pH對抗氧化多肽制備效果的影響
設(shè)定接種量為3.5%，發(fā)酵溫度為35℃，發(fā)酵時間為80 h，分別在pH為5，6，7，8，9和10六個梯度下，按照1.3.1和1.3.3的方法制備抗氧化多肽并且測其DPPH．清除率。由圖2可以看出，pH為8時，抗氧化多肽制備效果較好。
2.1.3發(fā)酵溫度對抗氧化多肽制備效果的影響
設(shè)定接種量為3.5%，pH為8，發(fā)酵時間為80 h，分別在發(fā)酵溫度為29℃，31 ℃，33 ℃，35 ℃．37 ℃和39℃六個梯度下，按照1.3.1和1.3.3的方法制備抗氧化多肽，并測其制備率。由圖3可以看出，發(fā)酵溫度為35℃時，抗氧化多肽制備效果較好。
2.1.4發(fā)酵時間對抗氧化多肽制備效果的影響
設(shè)定接種量為3.5%，pH為8，發(fā)酵溫度為35 ℃，分別在發(fā)酵時間為55，65，75，85，95和105h六個梯度下，按照1.3.1和1.3.3的方法制備抗氧化多肽并且測其DPPH．清除率。由圖4可以看出，發(fā)酵時間為85 h時，抗氧化多肽制備效果較好。
2.1.5制備抗氧化多肽的優(yōu)化試驗(yàn)
結(jié)合單因素試驗(yàn)的結(jié)果，分別接種量為2.5%，3.5%和4.5%，選取pH為7，8和9，發(fā)酵溫度為33℃，35℃和37℃，發(fā)酵時間為75，85和95 h，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化抗氧化多肽制備最佳工藝參數(shù)。因素水平見表1，結(jié)果見表2。
對抗氧化多肽制備進(jìn)行分析，接種量、pH、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間都是顯著因素。關(guān)于抗氧化多肽的DPPH．清除率二次回歸擬合方程：
由表3可以看出，模型的p<0.000 1，而失擬項(xiàng)的p=0.836 5，說明了抗氧化多肽制備的模型與實(shí)際情況擬合程度比較好，可以預(yù)測抗氧化多肽制備的條件。
由方差分析結(jié)果可以看出，AB的交互作用、AC的交互作用、AD的交互作用、BC的交互作用、BD的交互作用以及CD的交互作用都顯著。根據(jù)抗氧化多肽制備試驗(yàn)結(jié)果和回歸方程各項(xiàng)的方差分析，由響應(yīng)面分析法優(yōu)化出抗氧化多肽制備最佳工藝條件為：接種量3.4%、pH 7.6、發(fā)酵溫度35.4 ℃和發(fā)酵時間82.1 h。
2.2抗氧化多肽抗氧化活性研究
2.2.1豆粕制備的抗氧化多肽還原力測定
由圖5可以看出，隨著枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕制備的抗氧化多肽質(zhì)量濃度增加，吸光度不斷增大，相應(yīng)地還原力也依次增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度>0.9 mg/m L，吸光度與對照組VC差異顯著，明顯地高于對照組VC的吸光度。表明枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕制備的抗氧化多肽具有較強(qiáng)的還原能力
2.2.2豆粕制備的抗氧化多肽羥自由基(OH．)清除能力測定
由圖6可以看出，在試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕制備的抗氧化多肽質(zhì)量濃度增加，OH．清除率明顯提高，之后OH．清除率依次增大，最后趨向平緩。當(dāng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕制備的抗氧化多肽質(zhì)量濃度大于0.6 mg/m L時，相對于對照組VC，枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕制備的抗氧化多肽對OH．清除率較大。而且，在質(zhì)量濃度為1.8 mg/m L時，抗氧化多肽顯示出對OH．最強(qiáng)的抗氧化性，達(dá)到8 8.5%。表明枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕制備的抗氧化多肽是一種良好電子供體，具有較強(qiáng)清除OH．的能力。
3結(jié)論
枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕制備抗氧化多肽的最佳工藝條件為：接種量為3.4%、pH 7.6、發(fā)酵溫度35.4℃和發(fā)酵時間82.1 h。
枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕制備得到的抗氧化多肽具有較強(qiáng)的還原能力和較強(qiáng)清除OH．能力，高于對照組VC，而且隨著抗氧化多肽質(zhì)量濃度的增加，其還原能力和清除OH．能力也逐漸增強(qiáng)。因此，枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕制備得到的抗氧化多肽具有較好抗氧化活性。
