嘧菌酯降解菌的分離及降解動(dòng)力學(xué)分析
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李英東， 程軒， 肖梅， 陳軍
（上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234）
摘要：由于嘧菌酯的廣泛使用和殘留對(duì)環(huán)境中非靶標(biāo)生物有氧化脅迫作用，所以其危害越來(lái)越引起人們的關(guān)注。該文馴化篩選出一株高效降解嘧菌酯的菌株，并探討了其修復(fù)嘧菌酯污染的最適條件。利用嘧菌酯為唯一碳源篩選能有效降解嘧菌酯的菌株G7，對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)生理生化特征試驗(yàn)及16S rRNA基因同源性分析確定該菌株的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位。通過(guò)響應(yīng)面分析法和正交試驗(yàn)確定菌株G7外界和液體降解最優(yōu)條件。經(jīng)過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基和外界培養(yǎng)條件后得到48 h后在K：HPO。2 810 mg/L，KHZP04 781 mg/L，NI-kNO。1 000 mg/L，(NH4)2S04 821.39 mg/L，NaCl 825.16 mg/L，MgS04-7HZ0 1 000 mg/L，嘧菌酯168.86 mg/L，pH為7.25，溫度37℃，搖床轉(zhuǎn)速為175 r/min的條件下降解率最高為84.17%，并確定了G7菌株為施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri），通過(guò)降解動(dòng)力學(xué)建立了降解過(guò)程的數(shù)學(xué)模型。
關(guān)鍵詞：嘧菌酯； 降解動(dòng)力學(xué)分析； 生物降解； 響應(yīng)面分析； 分子生物學(xué)鑒定
嘧菌酯( azoxystrobin)是一種新型甲氧基丙烯酸酯（strobilurin）類殺菌劑，對(duì)由子囊菌亞門、擔(dān)子菌亞門、鞭毛菌亞門和半知菌亞門等大多數(shù)真菌引起的病害如白粉病、銹病、霜霉病、稻瘟病等均有良好的防治效果，現(xiàn)已開(kāi)發(fā)成為廣泛用作農(nóng)作物的殺菌劑。據(jù)預(yù)測(cè)到2015年嘧菌酯全球消費(fèi)量將達(dá)到近13 000 t，新增嘧菌酯的需求量為8 000 t。嘧菌酯是一種線粒體呼吸抑制劑，可通過(guò)阻斷細(xì)胞色素b和cl之間電子轉(zhuǎn)移抑制線粒體呼吸，破壞能量合成，從而發(fā)揮殺菌作用。隨著嘧菌酯的廣泛使用以及殘留，它對(duì)環(huán)境影響的研究也成為近年來(lái)人們關(guān)注的熱點(diǎn)。許靜等對(duì)嘧菌酯在不同pH下在土壤和水體中的殘留進(jìn)行的檢測(cè)顯示嘧菌酯的持久殘留會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的污染問(wèn)題。Kroglund等[7J分析嘧菌酯殘留量對(duì)大西洋鮭魚(yú)的毒性表明其對(duì)魚(yú)類尤其是其幼苗的線粒體有明顯的抑制作用。CM stoffersen等研究還顯示嘧菌酯對(duì)水蠅最低影響濃度僅為0.071 mg/L。韓穎楠等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)嘧菌酯會(huì)對(duì)斑馬魚(yú)肝臟的抗氧化防御系統(tǒng)產(chǎn)生影響，同時(shí)對(duì)斑馬魚(yú)肝臟和蚯蚓體腔細(xì)胞的DNA也有損傷作用，損傷程度隨嘧菌酯的濃度和染毒時(shí)間的升高而增長(zhǎng)。
生物治理是水環(huán)境生態(tài)修復(fù)的主要途徑，目前有關(guān)嘧菌酯生物降解的研究尚未有相關(guān)報(bào)道，本文報(bào)道一株高效嘧菌酯降解菌株的篩選，并通過(guò)響應(yīng)面分析法優(yōu)化菌株對(duì)嘧菌酯的降解條件，建立降解動(dòng)力學(xué)菌體降解的數(shù)學(xué)模型，為縮短嘧菌酯在環(huán)境中的殘留期，減少對(duì)環(huán)境中非靶標(biāo)生物的毒害作用。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 農(nóng)藥和土壤樣品來(lái)源
嘧菌酯標(biāo)樣：購(gòu)自阿拉丁標(biāo)準(zhǔn)試劑網(wǎng)，試劑CAS編號(hào)為131860-33-8；嘧菌酯：25%阿米西達(dá)一嘧菌酯懸浮劑，瑞士先正達(dá)公司生產(chǎn)（嘧菌酯原藥20%；NNO2.0%；拉開(kāi)粉3.0%；凹凸棒土2.0%；農(nóng)乳1600# 4.0%；農(nóng)乳500# 2.0%;吐溫2.0%；黃原膠0.15%；乙二醇8.0%；水補(bǔ)足至100%）
土壤樣品：采自上海奉賢地區(qū)長(zhǎng)期施用農(nóng)藥的耕種用土。
1.1.2 培養(yǎng)基
(1)基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基：K2HP04 1.5 g/L，KH2P04 0.5g/L,NH4N03 1.0g/L, (NH4)2S04 0.5 g/L,NaCl 0.5 g/L,MgSO。．7H。0 0.5 g/L，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要添加適當(dāng)?shù)泥拙?biāo)樣，pH 7.0，0.1 MPa蒸汽滅菌30 min（菌種篩選純化用）。
(2)LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0g/L，NaCl 10.0 g/L，pH 7.0，0.1 MPa蒸汽滅菌30 min。
(3)市售農(nóng)藥降解培養(yǎng)基：K2HP04 1.5 g/L，KH2P040.5 g/L,NI-LN03 1.0 g/L,(NH4)2S04 0.5 g/L, NaCl 0.5g/L，MgSO。．7H20 0.5 g/L，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要添加適當(dāng)?shù)氖惺坂拙ィ琾H 7.0。正交、響應(yīng)面及動(dòng)力學(xué)分析用。
1.1.3 儀器設(shè)備
Agilent 1260LC高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司），SCQ-2500F超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，ZHWY-2102C雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）等。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 高效降解菌的分離篩選及形態(tài)觀察
取上海市奉賢區(qū)長(zhǎng)期受農(nóng)藥污染的土樣10 g加入50 mL無(wú)菌水和8 mm玻璃珠數(shù)粒，漩渦振蕩10min。用無(wú)菌移液管取10 mL的土壤懸液加入含有100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)嘧菌酯的50 mL基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)液中，在37℃，150 r/min的條件下培養(yǎng)48 h后取10 mL培養(yǎng)液接入50 mL無(wú)菌的新鮮基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中（含有100mg/L嘧菌酯），再恒溫培養(yǎng)振蕩器培養(yǎng)48 h，同樣方法連續(xù)馴化富集4次。經(jīng)4次馴化富集后用漩渦振蕩菌液混合均勻后用無(wú)菌水中連續(xù)稀釋至10-5、10-6和10-7，并取每個(gè)梯度的稀釋液涂布于經(jīng)滅菌的以標(biāo)準(zhǔn)嘧菌酯為唯一碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)平板上，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h，待長(zhǎng)出菌落后，挑取生長(zhǎng)速度較快，菌落大且形態(tài)不一的菌落，再通過(guò)劃線分離，挑選單菌落進(jìn)行反復(fù)純化，直到菌落表面顏色、質(zhì)地等形態(tài)特征完全一致，并對(duì)篩得的菌株進(jìn)行斜面保存。
觀察并記錄在平板上長(zhǎng)出菌落的個(gè)體形態(tài)特征和菌落特征，并對(duì)菌體進(jìn)行革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)。將不同菌株以相同的接種量接種人以嘧菌酯農(nóng)藥為唯一碳源的50 mL基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)液中，在37℃，150 r/min的條件下培養(yǎng)48 h后，取降解液在7 000 r/min，10℃的條件下離心15 min后取上清液l mL通過(guò)水相針式濾器過(guò)濾降解液加入進(jìn)樣瓶中，用HPLC檢定培養(yǎng)液中嘧菌酯的殘留量，計(jì)算嘧菌酯降解率，篩選出降解率最高的降解菌株。
1.2.2 嘧菌酯校正曲線的繪制
稱取嘧菌酯標(biāo)準(zhǔn)樣品并制作梯度液，采用乙腈：水=5:3（體積比），流速：1.0 mL/min，柱溫：室溫，檢測(cè)波長(zhǎng)：255 nm，定量體積：10 p.L的方法繪制嘧菌酯校正曲線。
1.3 降解條件的優(yōu)化
對(duì)含有以市售嘧菌酯懸浮液的基本鹽培養(yǎng)基的各組分進(jìn)行優(yōu)化，利用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)每個(gè)因素設(shè)高、低2個(gè)水平(1，-1)，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。應(yīng)用Minitab統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行各因素的顯著性分析。再利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響因子最大的3個(gè)因素的水平進(jìn)行優(yōu)化，每個(gè)因素設(shè)高、中、低3個(gè)水平(1，0，-1)，高效液相檢測(cè)嘧菌酯殘留量。在加入市售嘧菌酯農(nóng)藥(1，0，-1)3個(gè)不同濃度水平的以嘧菌酯為唯一碳源的培養(yǎng)基中以相同接人量接種G7菌培養(yǎng)液（l mL于LB培養(yǎng)基中搖瓶48 h的菌液），分別檢驗(yàn)48 h后嘧菌酯降解率。計(jì)算得到關(guān)于降解率的回歸方程并計(jì)算出理論最優(yōu)培養(yǎng)基組分和最高降解率并對(duì)計(jì)算結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
以響應(yīng)面分析出的最優(yōu)培養(yǎng)基含量培養(yǎng)細(xì)菌，由于先進(jìn)行了菌種分子生物學(xué)鑒定，根據(jù)分子生物學(xué)鑒定結(jié)果查找相應(yīng)文獻(xiàn)后確定了菌種所屬的最適外界條件大致范圍；由于本實(shí)驗(yàn)篩選所得菌株在液體生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)聚集沉降，這種現(xiàn)象這對(duì)于通過(guò)分光光度計(jì)來(lái)測(cè)定菌體濃度有較大的影響，所以本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)將菌種培養(yǎng)液分多次進(jìn)行取樣離心后稱取其干重來(lái)表現(xiàn)菌體的生長(zhǎng)曲線，細(xì)胞濃度=細(xì)胞干重(mg)/取樣液體體積(mL)，通過(guò)正交試驗(yàn)分析搖床搖速、溶液pH以及溫度對(duì)菌體降解嘧菌酯和生長(zhǎng)率的影響，并計(jì)算出對(duì)降解菌降解嘧菌酯的降解速率和生長(zhǎng)率的最適搖床轉(zhuǎn)速、溶液pH、溫度。
1.3.1 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
通過(guò)Minitab 16軟件對(duì)Plackett-B urman和正交試驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果分析并繪制主效應(yīng)圖，Design -Expert8.06軟件對(duì)Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果分析并繪制等值圖和3D曲面圖。運(yùn)用SPSS軟件對(duì)G7菌在不同嘧菌酯濃度下隨時(shí)間變化的細(xì)胞濃度和降解率作顯著性分析。
1.4 菌種分子生物學(xué)鑒定
用試劑盒法提取篩選菌株基因組，以17F 1392R為引物對(duì)基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增的16S rRNA純化后由上海瑞楚生物技術(shù)有限公司直接測(cè)序。
1.5 降解動(dòng)力學(xué)分析
生物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是使用數(shù)學(xué)公式合理模擬微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中的菌體數(shù)量、底物濃度、產(chǎn)物之間的關(guān)系的一種有效方法。目前關(guān)于生物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究成果不斷更新，其模型也已經(jīng)提出很多類型，不同的模型適合的生物代謝反應(yīng)與程度各也不相同，在降解動(dòng)力學(xué)中常用的模型有：Eckenfelder模型、Ed-ward模型(1970)、Monod模型(1940)、Yano模型(1966)、Haldane模型(1965)、Webb模型(1963)等。由于嘧菌酯自身帶有毒性，對(duì)菌體生長(zhǎng)會(huì)有抑制和毒理作用，其中Haldane方程是較為常用的用來(lái)說(shuō)明底物對(duì)微生物有抑制作用的數(shù)學(xué)模型之一。
式中，qx為基質(zhì)最大降解比速率(h'1)；S為基質(zhì)質(zhì)量濃度(mg/L)；k為Monod基質(zhì)半飽和常數(shù)(mg/L)，k為基質(zhì)抑制系數(shù)(mg/L)。
以相同接種量將施氏假單胞菌屬（Pseudomonasstutzeri）接入到5種不同濃度(75、100、125、150、175mg/L)的嘧菌酯濃度中，每隔5h離心菌體后使用高效液相檢測(cè)上清液中嘧菌酯含量一次。使用Originpro對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行=階擬合，計(jì)算在固定的起始菌種濃度和培養(yǎng)條件下對(duì)不同初始濃度So(mg/L)的嘧菌酯中的降解特性。
2 結(jié)果與討論
2.1 嘧菌酯降解菌株的篩選及形態(tài)特征觀察
經(jīng)過(guò)在以嘧菌酯標(biāo)準(zhǔn)品為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基中連續(xù)富集逐級(jí)馴化培養(yǎng)，從采集地樣品中分離篩選得到4株細(xì)菌，分別編號(hào)為G1、G3、G5、G7，其在LB平板上的菌落形態(tài)特征如表1所示。其中G7菌在48 h時(shí)降解率最高為73.24%。
2.2 嘧菌酯降解茵降解條件優(yōu)化
Plackett-B urman試驗(yàn)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析表如表2所示；Plackett -B urman實(shí)驗(yàn)主效應(yīng)圖如圖1所示；Box-Behnken試驗(yàn)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析表如表3所示；Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果的曲面圖如圖2所示。經(jīng)計(jì)算，在培養(yǎng)基最優(yōu)條件下降解率最高為82.96%；通過(guò)5組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)顯示在最優(yōu)培養(yǎng)基條件下嘧菌酯平均降解率為83.2%，與預(yù)測(cè)值相近，最優(yōu)培養(yǎng)液成分含量結(jié)果如圖3所示。嘧菌酯降解的回歸方程為：降解率=82.79 +0.66 xA+2.24 xB -0.54 xC +4.18 xAB+1.38xAC_1.08xBC_5.92xA2_11.47xB2_16.23 xC2(A為( NH4)2S04；B為NaCl;C為嘧菌酯）回歸方程方差分析結(jié)果和回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，由表5可知，模型回歸P>F的值小于0.001，可知該模型與實(shí)際值較為相符，結(jié)果可靠。
正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表4，正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析如表6所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果主效應(yīng)圖如圖4所示。由于正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析顯示各項(xiàng)P值均小于0.05，具有可信度，因此根據(jù)主效應(yīng)圖所示，G7菌降解嘧菌酯的最佳外界條件如表7所示。在最優(yōu)外界和最優(yōu)培養(yǎng)基條件下經(jīng)過(guò)3次平行驗(yàn)證得到G7菌對(duì)嘧菌酯的平均降解率為84.17%。
2.3 菌體的分子生物學(xué)鑒定及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
將獲得的16S rRNA基因序列登陸GenBank獲得通過(guò)ncbi網(wǎng)站中的BLAST進(jìn)行在線序列同源性比對(duì)，結(jié)果顯示G7菌的序列與施氏假單胞菌屬（Pseudomonas stutzeri）的多個(gè)施氏假單胞菌具有99%以上的一致性，分析后初步確定G7為施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri).
2.4 G7菌株的生長(zhǎng)曲線及農(nóng)藥降解曲線繪制
在含有75、100、125 mg/L嘧菌酯濃度的以嘧菌酯為唯一碳源的培養(yǎng)基中以相同的接入量接入G7菌，G7菌在不同濃度的嘧菌酯溶液中的生長(zhǎng)曲線如圖5所示，由圖5可見(jiàn)0—5 h在所有濃度中的G7菌生長(zhǎng)緩慢處于延滯期，在5—35 h所有濃度中G7菌的菌濃度都顯著增長(zhǎng)，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，其中在100 mg/L的濃度中增長(zhǎng)較為快速，在75 mg/L的濃度下增長(zhǎng)較為緩慢，35 h后進(jìn)入平穩(wěn)期。通過(guò)高效液相檢測(cè)繪制G7菌在不同嘧菌酯濃度下的50 h降解曲線，從圖5中可得知G7菌在0—10 h中對(duì)125 mg/L的嘧菌酯降解率最高，在10～40 h時(shí)間段中對(duì)100 mg/L的嘧菌酯降解率最高，在40 h后G7菌對(duì)各個(gè)濃度的嘧菌酯降解率基本相同。不同嘧菌酯濃度下菌體細(xì)胞濃度與降解率之間的顯著性分析如表8、表9、表10所示。3組顯著性分析結(jié)果都有P<0.05，可見(jiàn)細(xì)胞濃度對(duì)嘧菌酯的降解率影響顯著。從以上數(shù)據(jù)中得出嘧菌酯降解率的升高與G7菌的細(xì)胞濃度增長(zhǎng)密切相關(guān)；由此說(shuō)明G7菌能把嘧菌酯作為生長(zhǎng)過(guò)程中所需的碳源來(lái)分解利用，但在實(shí)際情況中由于市場(chǎng)中的使用農(nóng)藥與表準(zhǔn)樣品中藥物成分不一，菌體也有可能會(huì)利用市售農(nóng)藥中的其他碳類化合物作為有機(jī)物利用，因此在50h時(shí)嘧菌酯的降解率任然無(wú)法達(dá)到100%。
2.5 降解動(dòng)力學(xué)分析
比降解率在不同濃度嘧菌酯中的變化見(jiàn)表11。
擬合曲線如圖6所示。根據(jù)方程可計(jì)算得：q一=1.245 3，kr314.909 8，kr57.173 6。則動(dòng)力學(xué)方程為：
擬合曲線分析表如表12所示。
3 結(jié)果與討論
本文通過(guò)實(shí)施嘧菌酯選擇性壓力馴化篩選出一株高效降解菌株G7，并運(yùn)用響應(yīng)面分析法和正交試驗(yàn)確定了該菌的最適降解條件。同時(shí)通過(guò)16S rRNA的方法初步鑒定了該菌為施氏假單胞菌（Pseu -domonas stutzeri），而有關(guān)該菌株對(duì)嘧菌酯降解性能尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。本次的研究結(jié)果為生態(tài)環(huán)境中殘留嘧菌酯的生物降解提供了新方法，通過(guò)響應(yīng)面和正交試驗(yàn)得到了各項(xiàng)化學(xué)成分和環(huán)境因素對(duì)降解菌降解率的影響同時(shí)為進(jìn)一步研究在自然環(huán)境中各化學(xué)元素含量對(duì)降解菌降解率提供了依據(jù)，本次實(shí)驗(yàn)的正交和動(dòng)力學(xué)分析都采用了市售嘧菌酯懸浮劑來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)條件更加貼近真實(shí)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境，實(shí)驗(yàn)有效證實(shí)了所篩菌種在真實(shí)的自然環(huán)境和漁業(yè)生產(chǎn)中具有一定的環(huán)境保護(hù)和降低毒害作用，但對(duì)于市售農(nóng)藥其他成分對(duì)菌株的影響以及菌株降解嘧菌酯的代謝途徑還有待于進(jìn)一步地研究。
