柚花不同溶劑提取物抗氧化作用研究
羅鋁鏗1*．郭佳茵1，劉家麗1，劉孟華2
1．嘉應學院醫(yī)學院(梅州514015)；2南方醫(yī)科大學藥學院（廣州510515）
摘要研究分別采用DPPH法、鄰苯三酚自氧化法、鄰二氮菲-Fe2+研究柚花水提物、乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、石油醚提取物清除DPPH自由基、超氧自由基和羥自由基的能力。結果表明柚花提取物均對DPPH自由基、超氧自由基和羥自清由基有除能力，并在一定濃度范圍和清除率成線性正相關。柚花提取物均具有清除自由基的能力，其中水提取物和乙醇提取物抗氧化能力較好。
關鍵詞柚花；抗氧化；羥自由基；超氧自由基；DPPH
柚花又稱橘花，為蕓香科植物柚(Citrus grandis(L．) Osbecd)的花或花蕾，香氣悠長，具有行氣、除痰、止痛的功效，可作為花茶飲用。其來源豐富，據不完全統計，中國擁有柚的品種達120個以上，廣泛分布于中國亞熱帶地區(qū)，四川、廣東、廣西、福建、湖南、江西等地均有大面積種植。柚樹開花期需進行疏花，大約95%的花需要疏去，由于目前關于柚花的研究極少，大量的疏花被廢棄，造成了資源的嚴重浪費。
人體新陳代謝會產生大量的自由基，包括超氧自由基、羥自由基等，據研究自由基可以引起動脈粥樣硬化、老年癡呆等100多種疾病，是生物體衰老的主要因素之一，從天然果蔬及中草藥中開發(fā)安全無毒的抗氧化劑是目前發(fā)展的趨勢。試驗采用不同極性溶劑直接對柚花進行提取，采用用多種抗氧化活性評價方法評價不同總提取物抗氧化活性，測定不同溶劑提取物中黃酮、多酚、酚酸含量并分析相關性，以期為柚花相關產品的研發(fā)提供可靠的試驗數據和理論依據。
1 材料與方法
1.1材料、儀器與設備
柚花：2014年4月采自梅州市石馬鎮(zhèn)；二苯代苦味�；杂苫�( DPPH)：分析純，Sigma化學有限公司（美國）；鄰苯三酚，分析純：Sigma化學有限公司；蘆丁：色譜純，上海億欣生物科技有限公司；鄰二氮菲、過氧化氫、硫酸亞鐵、三氯化鐵、十二烷基磺酸鈉、鐵氰化鉀、酒石酸鉀鈉、無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯均為國產試劑，分析純。
72 1型紫外可見光分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科技有限公司；HWS-26電熱恒溫水浴鍋。
1.2試驗方法
1.2.1柚花不同溶劑提取物的制取
方法略作改動。將新鮮采摘的柚花置于40℃烘箱中烘干，分別用10倍劑量的水、無水乙醇、乙酸乙酯、石油醚加熱回流提取1h，濾渣再用10倍劑量的溶劑提取1h，合并兩次濾液，將提取液減壓濃縮，干燥至恒重備用，按公式(1)計算不同提取方法出膏率，并配制成不同濃度溶待用。
出膏率=干膏質量/藥材質量×100% (1)
1.2.2清除DPPH自由基能力的測定
方法略作改動。將由1.2.1制得的不同溶劑提取物用無水乙醇溶解并配制為一系列不同濃度受試樣品乙醇液分別取2.0 m L待測液與的2.0 m L 0.2 m mol/L DPPH乙醇溶液混合，振搖均勻后，于518 nm處測定吸光度(Ai)同時測2.0 m L 0.2 m mol/L DPPH溶液與2.0 m L無水乙醇混合液的吸光度（Ai），以及2.0 m L待測液與無水乙醇混合液的吸光度(Ac)。每樣測定3次并取平均值，按公式(2)計算DPPH自由基清除率。以蘆丁為對照進行比較。
1.2.3清除超氧自由基O2-能力的測定
方法參考文獻并略作改動。配制待測液濃度為2mg/L，取10 m L比色管依次加入3 m L PBS緩沖液(pH8.4)，3 m L 0.05 m mol/m L鄰苯三酚溶液，0.5 m L待測液，加三蒸水稀釋至刻度，每隔30 s測其在325 nm處的吸光度，共6 min，繪制曲線計算得到樣品氧化速率斜率K1；將待測液以三蒸水代替，同樣條件下測其吸光度，并計算。作圖分別計算出鄰苯三酚自氧化速率K0，根據公式(3)計算清除率。以蘆丁為對照進行比較。
1.2.4清除羥自由基能力的測定
采用鄰二氮菲_Fe2+氧化法測定柚花提取物清除羥自由基的能力。在試管中依次加入0.2 m mol/LPBS，去離子水1 m L搖勻，加入0.75 m mol/L FeSO4，1 m L，充分混勻；加入0.01% H2O2，震蕩1 min;加入0.75 m mol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液1 m L，37 0C水浴60 min。于535 nm處測定吸光度A p；以不同濃度樣品溶液代替去離子水，測定吸光度As；以去離子水代替H2O2，測定吸光度A b；每樣測定3次取其平均值，按公式(4)計算羥自由基清除能力。以蘆丁為對照進行比較。
1.2.5黃酮含量測定
依據2010年版《中國藥典》檢測蘆丁含量。精密稱取蘆丁標準品20.0 mg，置100 m L的棕色容量瓶中，加70%乙醇微熱溶解，冷卻至室溫，用70%乙醇稀釋至刻度。搖勻，制得對照品0.20 mg/m L的蘆丁。精密移取蘆丁對照品0.0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 m L，置25 m L容量瓶中，各加蒸餾水5.0 m L，加入5%的NaNO2溶液1.0 m L，搖勻放置6 min，加入10% Al(NO3)3 1.0m L，放置6 min，加入4% Na OH 10.0 m L，用70%的乙醇定容至刻度，放置15 min。用空白試劑作對照，在510 nm處測吸光度。以蘆丁含量(mg/m L)為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。得到回歸方程為y=12.446x+0.012 9,R2=0.999 9。
準確移取1.0 mg/m L提取物溶液1.0 m L分別置于25m L的容量瓶中根據標準曲線制作方法測定四份樣品的吸光度，根據回歸方程計算黃酮含量。
1.2.6總酚酸含量測定
方法略作改動。精密稱取沒食子酸29.6 mg于小燒杯中，用無水乙醇溶解，25 m L容量
瓶中定容，準確移取1.0 m L于50 m L容量瓶中定容，配成23.68 μg/m L的對照品溶液。精密移取對照品0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 m L分別置于25 m L容量瓶中，加無水乙醇至25.0 m L，加入0.3%的十二烷基磺酸鈉2.0 m L, 1%的鐵氰化鉀和1%的三氯化鐵(1：1)混合2.0 m L，搖勻，暗處放置5 min，加0.10 mol/L的鹽酸至25.0 m L，搖勻，暗處放置20 min，平行空白，用紫外分光光度計在740 nm處測量吸光度。以吸光度為J，，濃度為x，建立回歸方程：y=0.846 8x-0.034 5，R2=0.999 7。
準確移取1.0 mg/m L提取物溶液0.3 m L分別置于25m L的容量瓶中根據標準曲線制作方法測定樣品吸光度，根據回歸方程計算總酚酸含量。
1.2.7多酚含量測定
本方略作改動。移取3.6 m L 0.10mol/L的硫酸亞鐵置小燒杯中，準確稱取0.5 g酒石酸
鉀鈉，混合后加蒸餾水溶解，定容到100 m L，并于低溫，避光環(huán)境中保存。準確吸取0.20 mg/m L的對照品0.5，1.0，2.0，3.0和4.0 m L分別置于25 m L容量瓶中，加蒸餾水至5.0 m L，再加入5.0 m L酒石酸亞鐵溶液充分混合，再加入pH 7.6的磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，充分混勻，靜置15 min，在波長540 nm處測定A，同時以蒸餾水作為參照。以吸光度為y，濃度為x，建立回歸方程：y=6.75x+0.045 7．R2=0.998 2。
準確移取1.0 mg/m L提取物2.0 m L分別置于25 m L的容量瓶中根據標準曲線制作方法測定樣品吸光度，根據回歸方程計算多酚含量。
1.2.8數據分析
IC50指當自由基清除率達到50%時的樣品濃度，以提取物濃度為自變量，自由基清除率為因變量進行線性擬合分析，根據線性公式計算IC50。采用SPSS16.0以相關系數法和p檢驗，對四種提取物的主要成分含量( mg/m L)與自由基清除率IC50值(%)進行相關性分析。
2結果與分析
2.1不同極性溶劑提取方法出膏率
出膏率是衡量提取效率常用的指標之一，從結果來看，不同極性溶劑提取出膏率相差較大，次序為水>無水乙醇>乙酸乙酯>石油醚，結果見表1。
2.2對DPPH自由基清除率
DPPH是目前應用最廣泛的評價果蔬抗氧化能力方法之一。四種提取物對DPPH自由基都有一定的清除能力，隨著濃度的升高，不同提取物對DPPH自由基的清除率也逐漸增強，并呈良好的線性關系，結果見圖1，通過回歸方程計算得出四種提取物的半清除率IC50見表2。四種提取物對于DPPH自由基都有弱的清除作用，相對于其他三種提取物，其中無水乙醇
提取物半清除率最小，說明其對DPPH自由基清除能力較強，而石油醚提取物抗氧化能力最弱。
2.3對超氧自由基的清除率
超氧自由基具有較強的毒性，是體內產生的主要自由基之一，可以轉化為多種其他自由基。柚花不同溶劑提取物對超氧自由基的清除率在一定范圍內與濃度呈線性正相關，繪出相應曲線，計算IC50。結果見圖2及表3。結果表明，柚花提取物具有一定的超氧自由基清除能力。柚花不同溶劑提取物對超氧自由基均有一定的清除能力，乙醇提取物>乙酸乙酯提取
物>水提物>石油醚提取物。
2.4對羥自由基清除率
試驗結果表明，柚花不同溶劑提取物對羥自由基的清除率在一定范圍內與濃度呈線性正相關，繪出相應曲線，計算IC50。結果見圖3及表4。柚花不同溶劑提取物均對羥自由基具有一定的清除力，按清除力大小依次為：水提取物>乙醇提取物>乙酸乙酯提取物>石油醚提取物。
2.5 柚花不同溶劑提取物總黃酮、總多酚和總酚酸含量
通過對柚花不同溶劑提取物中有效成分檢測發(fā)現，不同提取物中有效成分含量相差較大。黃酮和總酚酸在無水乙醇提取物中含量為最多，多酚在水提物中含量最多，而這三種成分在石油醚中均含量最少，結果見表5。
2.6相關性分析
將3種不同體系評價得到的抗氧化能力分別與四種提取物的總黃酮、總酚酸和多酚的含量作相關性分析，結果如表6所示。黃酮和酚酸的含量與三種方法測得的IC50值相關性均較弱，多酚含量與DPPH，鄰二氮菲羥自由基清除兩種測定方法測得的IC50相關性較弱，而與超氧自由基清除測定方法測得的IC50值呈顯著相關，R2=-0.986( p<0.05)。
3結論與討論
在DPPH清除自由基的體系中，抗氧化能力強弱順序為：無水乙醇提取物>水提取物>乙酸乙酯提取物>石油醚提取物；在羥自由基清除體系中，抗氧化能力強弱順序為：無水乙醇提取物>水提取物>乙酸乙酯提取物>石油醚提取物；在超氧自由基清除的體系中，抗氧化能力強弱順序為：水提取物>無水乙醇提取物>乙酸乙酯提取物>石油醚提取物。和維生素C相比，柚花不同溶劑提取物抗氧化能力均較弱。
黃酮、酚酸的含量與三種方法測得的lC50值相關性均較弱，多酚含量與DPPH、鄰二氮菲羥對自由基清除兩種測定方法測得的IC50相關性較弱，而與超氧自由基清除測定方法測得的lC50值呈顯著相關，R2=-0.986( p<0.05)，提示多酚可能是清除超氧自由基的主要有效成分，且柚花提取物抗氧化能力不僅與其有效成分的含量有關，可能還與種類有關。
柚花香氣悠長，在古代就已經被用作香料，是清代宮廷化妝品面脂的原料之一，《本草綱目》言其“可使長發(fā)潤澤”，也可作為花茶食用。天然，高效，安全的抗氧化劑是目前食品發(fā)展的方向，試驗證明柚花具有一定的抗氧化能力，且活性物質多集中在水相和乙醇相中，綜合出膏率，成本及溶劑殘留等因素，水是提取柚花中抗氧化功效成分的較好溶劑，研究結果為柚花系列食品及飲料研發(fā)提供理論依據。
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