大孔樹脂分離純化紫甘藍中的花色苷
任萍*，袁曉雨，趙曉萌，徐慧娟，肖立偉，王東升
廊坊師范學院（廊坊065000）
摘要采用大孔吸附樹脂法純化紫甘藍中的花色苷，考察不同極性樹脂對花色苷的靜態(tài)吸附性能及動態(tài)吸附性能和純化效果的影響，確定紫甘藍花色苷的純化工藝條件。研究發(fā)現(xiàn)HPD 500樹脂對花色苷的吸附選擇性最好。以色價為標準，同時考慮到吸附率和解吸率，確定了HPD 500樹脂對紫甘藍中花色苷的純化工藝條件。結果表明，HPD 500樹脂純化花色苷的最佳條件為：上柱液pH 2.5，上柱液吸光度0.707，上柱液體積1.5 BV，吸附流速1.5 BV/h，洗脫流速1.5 BV/h，解吸液為質量分數(shù)60%的酸性乙醇(pH 2.5)。最佳條件下得紫甘藍花色苷色價為47.8，提高為初始值(2.3)的20.8倍。
關鍵詞 大孔吸附樹脂；紫甘藍；花色苷；純化
食品加工過程中經常涉及食品的染色，會經常使用一種食品添加劑——食用色素。近些年來隨著醫(yī)學、毒理學和生物學研究工作的不斷深入，在食品工業(yè)中大量使用的合成色素被認為對人體有害，有的甚至致癌。因而世界衛(wèi)生組織及各國開始禁用一些合成色素，例如莧菜紅等，這些禁令促進了人們對于天然色素的研究。
花色苷是花色素與糖以糖苷鍵結合而成的一類天然水溶性色素，主要存在于花卉、果實及有色葉片中，使其呈現(xiàn)由紅、紫紅到藍等不同顏色。研究表明，花色苷類化合物具有顯著的生理活性：例如抗自由基、改善視力、預防心血管疾病、提高認知能力、抗腫瘤和抗突變等。但是大部分天然色素從植物中提取出來會含有很多的雜質，這會影響到天然色素的穩(wěn)定性和染色力，因此需要對天然色素進行純化。大孔吸附樹脂是近十幾年發(fā)展起來的一種新型高分子吸附劑；目前，大孔吸附樹脂主要應用于環(huán)保、醫(yī)藥工業(yè)、化學工業(yè)、分析化學和臨床鑒定等多個領域，廣泛應用于天然產物有效成分的分離純化研究。紫甘藍屬十字花科蕓薹屬，又名紫卷心菜，也叫紫圓白菜，它作為一種食用性蔬菜在我國已大面積種植。從紫甘藍菜中提取得到的色素，屬于蔬菜花色素苷類物質，色澤鮮艷，使用安全無毒，是一種新型的天然色素。文獻中利用大孔樹脂純化其它植物中色素的研究較多，但目前對紫甘藍中花色苷的研究多為其提取工藝及其性質研究，或大孔樹脂對紫甘藍花色苷吸附及解吸性能的研究，利用大孔吸附樹脂對紫甘藍花色苷純化的研究較少，J．Chandrasekhar和賀菊萍等利用大孔樹脂純化紫甘藍色素，重點研究了樹脂與紫甘藍色素的吸附、洗脫條件，主要以吸附和解吸率作為評價標準，并沒有以花色苷純度或者花色苷的色價作為評價純化效果的標準。
試驗以紫甘藍為原料，研究不同極性大孔吸附樹脂對紫甘藍中花色苷的吸附解吸性能，以純化后花色苷的色價為標準，探討純化工藝參數(shù)，找到適合純化紫甘藍色素的最佳樹脂，得到具有高純度、高色價的紫甘藍色素提取物，為紫甘藍花色苷純化及利用提供理論依據(jù)，同時也將對擴大天然食用色素品種和綜合利用農產資源具有實際意義和經濟效益。
1 材料與方法
1.1材料與試劑
新鮮紫甘藍：河北廊坊。
不同極性大孔吸附樹脂：如表1所示，河北省滄州寶恩吸附材料科技有限公司。
冰乙酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、無水乙醇，均為分析純。
1.2儀器與設備
TU-1201紫外可見分光光度計：北京大華辰光電子有限公司；pHS-2F pH計：上海右-儀器有限公司；RE-52A旋轉蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；TH2-82A水浴恒溫振蕩器：金壇市榮華儀器制造有限公司。
1.3方法
1.3.1 紫甘藍花色苷粗提液的制備
將新鮮紫甘藍洗凈切碎后，以質量分數(shù)60%酸性乙醇（用醋酸調節(jié)，pH 2.5）做提取溶劑，料液比為1：10( g/m L)，35℃下浸提4h后抽濾，得花色苷粗提液。
1.3.2花色苷粗提液的濃縮
取一定量花色苷粗提液置于旋轉蒸發(fā)儀中，35℃下將花色苷粗提液濃縮，再將濃縮液置于真空干燥箱中，35℃下將濃縮液烘干成花色苷粗提物。
1.3.3花色苷提取液吸收光譜的測定
用pH 2.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液將一定量花色苷粗提物配制成溶液，在400～800 nm范圍內對其進行波長掃描，得到pH 2.5時花色苷的可見光吸收光譜圖，得出此條件下的最大吸收波長。
1.3.4大孔吸附樹脂的預處理
用乙醇作為溶劑，將一系列不同極性的樹脂，利用索氏提取器進行抽提8h。晾干后用蒸餾水洗至無醇，濾出樹脂，用水浸泡待用。
1.3.5大孔吸附樹脂對花色苷的靜態(tài)吸附
精確稱取處理好的濕樹脂( HPD 100，HPD400, HPD 500, HPD 600, HPD 826和ADS 17)各1
g，分別置于錐形瓶中加入吸光度為0.880的花色苷樣品液30 m L，具塞，置于恒溫振蕩器上于25℃，120 r／min振蕩至吸附平衡，測定吸附后溶液吸光度。將吸附后的樹脂濾出，加入30mL 60%酸性乙醇（用醋酸調節(jié)，pH 2.5），具塞，置于恒溫振蕩器上于25 ℃，120 r/min振蕩至解吸平衡時間以上，測定解吸液吸光度。并根據(jù)式(1)和(2)計算出吸附率、解吸率。
式中：A0、A1和A2分別為吸附前、吸附后和解吸液的吸光度；V0、V1和V2分別為吸附前、吸附后和解吸液的體積，m L。
1 .3.6大孔吸附樹脂對花色苷的動態(tài)吸附
1.3.6.1 色價與吸附率、解吸率的測定
色價是單位質量原料的提取物在1 g/L質量濃度、以1cm比色皿在其最大吸收峰處的吸光度。精確稱取花色苷提取物，溶于蒸餾水中，調節(jié)pH 2.5，在最大吸收波長下測定其吸光度，根據(jù)式(3)測定色價。
式中：A為實測試樣的吸光度；偽稀釋倍數(shù)； m為試樣質量，g。
動態(tài)吸附率與解吸率計算與1.3.5靜態(tài)吸附率、解吸率計算一致。
1.3.6.2動態(tài)吸附溶液的制備
將1.3.2得到的花色苷粗提物，用適量蒸餾水溶解，用冰乙酸調節(jié)pH 2.5，測定花色苷溶液的吸光度，作為動態(tài)吸附的上柱液。
1.3.6.3 動態(tài)吸附過程
分別量取濕樹脂HPD 100，HPD 400，HPD500, HPD 600和HPD 826各20 m L裝層析柱(長徑比20：1)。各取40 m L吸附溶液上柱，以40 BV/h的吸附流速將吸附液通過上述五種樹脂分離柱，再配制一定量用醋酸調節(jié)pH 2.5，質量分數(shù)60%的乙醇水溶液，將樹脂上吸附的物質洗脫至無色，收集流出液和解吸液。測定純化前、流出液和解吸液的吸光度，并計算出吸附率和解吸率。
將解吸液置于真空干燥箱中，35℃下烘干至恒重，準確稱其質量，并用pH 2.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液溶解，定容于50 m L容量瓶中，在最大吸收波長處測其吸光度A，計算色價。采用純化后提取物的色價作為衡量花色苷純化效果的指標，同時兼顧吸附率和解吸率篩選出最佳樹脂。
1.3.7樹脂最佳動態(tài)吸附條件的優(yōu)化
1.3.7.1 吸附溶液pH對吸附的影響
5份濕樹脂HPD 500各20 m L裝柱，配制pH為2.5時吸光度為0.875的花色苷水溶液，分別用醋酸調節(jié)不同的pH為2.0，2.5，3.0和3.5，上柱液體積2 BV，調節(jié)吸附流速2 BV/h，吸附完畢后用pH 2.5，質量分數(shù)60%的酸性乙醇以2 BV/h速率洗脫至無色，測定流出液和 洗脫液吸光度，計算吸附率，并將洗脫液真空35℃蒸干測定色價。
1.3.7.2上柱液體積對花色苷純化的影響
5份濕樹脂HPD 500各20 m L裝柱，配制pH為2.5時吸光度為0.875的花色苷水溶液，上柱液體積分別為1，1.5，2，2.5和3 BV，調節(jié)吸附流速2 BV/h，吸附完畢后用pH 2.5，質量分數(shù)60%的酸性乙醇以2 BV/h速率洗脫至無色，測定流出液和洗脫液吸光度，計算吸附率。并將洗脫液于35℃真空蒸干，測定色價。
1.3.7.3上柱液吸光度對花色苷純化的影響
5份濕樹脂HPD 500各20 m L裝柱，配制pH為2.5時 吸光度分別為0.930，0.799，0.707，0.610和0.510的花色苷水溶液，上柱液都為40 m L，調節(jié)吸附流速2 BV/h，吸附完畢后用質量分數(shù)60%酸性乙醇以2 BV/h速率洗脫至無色。動態(tài)吸附后測定流出液和洗脫液吸光度，計算吸附率。并將洗脫液于35℃真空蒸于，測定色價。
1.3.7.4吸附流速對花色苷純化的影響
5份濕樹脂HPD 500各20 m L裝柱，取pH為2.5時吸光度為0.910的花色苷水溶液5份各40 m L上柱，調節(jié)吸附流速分別為1，1.5，2，2.5和3 BV/h，吸附完畢后用質量分數(shù)60%酸性乙醇以2 BV/h速率洗脫至流出液無色，動態(tài)吸附后測定流出液和洗脫液吸光度，計算吸附率。并將洗脫液于35℃真空蒸干，測定色價。
1.3.7.5洗脫流速對花色苷純化的影響
5份濕樹脂HPD 500各20 m L裝柱，配制吸光度為0.910的花色苷水溶液各40 m L上柱，調節(jié)吸附流速2 BV/h，用40 m L質量分數(shù)60%酸性乙醇洗脫，調節(jié)洗脫流速分別為1，1.5，2，2.5和3 BV/h，動態(tài)吸附后測定流出液和洗脫液吸光度，計算解吸率。并將洗脫液于35℃真空蒸干，測定色價。
1.3.7.6洗脫液乙醇質量分數(shù)對花色苷純化的影響
5份濕樹脂HPD 500各20 m L裝柱，取吸光度為0.815的花色苷水溶液5份各40 m L，調節(jié)吸附流速為2 BV/h，吸附后分別用質量分數(shù)為40%，50%，60%，70%和80%的酸性乙醇以2 BV/h速率洗脫至無色，測定流出液和洗脫液吸光度，計算解吸率。并將洗脫液于35℃真空蒸干，測定色價。
1.3.7.7最佳條件的驗證
在上述步驟得到樹脂的最佳動態(tài)吸附條件下對花色苷粗提液進行純化，得到花色苷洗脫液，于35℃真空蒸干，測其色價，計算吸附率和解吸率。
1.3.8數(shù)據(jù)處理
以上試驗數(shù)據(jù)均重復3次，取平均值。
2結果與分析
花色苷在酸性條件下( pH 2～3)比較穩(wěn)定，花色苷的粗提取試驗都是在pH 2.5條件下進行的，如圖1為pH 2.5時花色苷的全波長掃描，最大吸收波長為530nm，所以花色苷的測定波長為530 nm。
2.1 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附結果
表2表示了室溫25℃下大孔樹脂對花色苷的靜態(tài)吸附率及解吸率。從表中可以看出，這幾種樹脂對花色苷的吸附率以HPD 100最高為91.8%，HPD 400次之，為85.7%，最低的為ADS17，靜態(tài)解吸率都超過60%，其中ADS17解吸最高。說明ADS17樹脂對花色苷的吸附力弱，吸附容量小。但是要想研究樹脂對花色苷的純化效果，單看靜態(tài)的吸附率和解吸率是不夠的，所以采用動態(tài)吸附手段來研究它們純化效果的差異，在后續(xù)試驗中剔除了吸附量極小的ADS17樹脂，將余下五種樹脂進行動態(tài)吸附試驗，引入純化后花色苷的色價作為標準，同時考慮動態(tài)吸附率和解吸率，以優(yōu)選出最佳樹脂。
2.2動態(tài)吸附結果
2.2.1動態(tài)吸附樹脂的篩選
相同濃度花色苷提取液先后經歷五種樹脂的吸附和解吸過程。表3為不同樹脂對花色苷的純化效果，可知，HPD 500樹脂可以獲得較高色價的花色苷。這是因為紫甘藍中的花色苷是具有一定極性的物質，而HPD 500樹脂也是極性樹脂（見表1），樹脂極性與紫甘藍花色苷的極性恰好相匹配，極性與疏水協(xié)同作用，從而提高了樹脂對花色苷色素的吸附選擇性。由表3還可以知道，動態(tài)吸附中HPD 100，HPD 500和HPD 600三種樹脂的吸附率及解吸率都很高，HPD826對紫甘藍花色苷的動態(tài)解吸率較低，這是由于HPD 826大孔樹脂是氫鍵樹脂（見表1），其結構上含有較多的酰胺基團，與花色苷上的酚羥基發(fā)生很強的氫鍵作用，導致紫甘藍花色苷被吸附后難以全部解吸下來。以色價最為主要考慮指標，同時考慮到吸附率和解吸率，選擇HPD 500樹脂來探索最佳條件。
2.2.2HPD 500樹脂的最佳吸附條件
2.2.2.1 吸附溶液pH對樹脂吸附的影響
吸附溶液pH對HPD 500樹脂純化花色苷效果的影響結果如圖2所示。樹脂HPD 500隨著上柱液pH的增加吸附率先增后略減，在pH 2.5和pH 3時吸附率最高，在較強酸性條件下花色苷主要以花翁鹽形式存在，不易被樹脂吸附；而在酸性不太強的條件下，花色苷較多地保持了分子形態(tài)，容易被樹脂吸附，同時考慮到解吸后花色苷色價在pH 2.5時最高，而且花色苷在酸性條件下比較穩(wěn)定，所以選擇最佳吸附溶液pH為2.5。
2.2.2.2上柱液體積對樹脂吸附的影響
上柱液體積對兩種樹脂純化效果的影響結果如圖3所示，樹脂HPD 500上柱液體積為1.5 BV和2 BV時，色價較高。而吸附率隨著上柱體積增加而減小，因為上柱液體積太大會發(fā)生泄漏，考慮到上柱液為2 BV時吸附率稍低所以選擇最佳上柱體積為1.5 BV。
2.2.2.3花色苷上柱液濃度對樹脂吸附的影響
由圖4可知，花色苷上柱液濃度影響樹脂的吸附性能。對于定量的吸附劑而言，吸附質用量增大，意味著吸附比表面增大，吸附質在吸附劑上的分布較松散，從而吸附劑對吸附質的物理作用和化學作用加強，吸附量增加。從圖中可以看出隨著上柱液濃度的增加，吸附率有少量下降。從純化效果看，溶液濃度低時得到的花色苷色價較小，隨著上柱液吸光度的增大，可以得到較高色價的紫甘藍花色苷色素。但隨著上柱液吸光度繼續(xù)增加，色價又有所下降�？紤]到色價和吸附率的選擇，上柱液最佳吸光度為0.707。
2.2.2.4吸附流速對樹脂吸附的影響
圖5表示了HPD 500樹脂吸附流速對色價及吸附率的影響，隨著吸附流速增大，吸附率降低，可見較慢的流速有利于樹脂對色素的吸附。但是從純化效果來看比較復雜，吸附流速從小到大，色價先增加后減小再增加。流速為1.5 BV/h時，純化后色價比較高。當吸附流速為3 BV/h時，雖然色價也較高，但是吸附率明顯下降，出現(xiàn)了明顯的泄漏現(xiàn)象。因此選擇最佳吸附流速為1.5 BV/h。
2.2.2.5洗脫流速對樹脂純化效果的影響
洗脫流速影響樹脂的解吸性能及純化效果。圖6顯示，對于樹脂HPD 500，隨著洗脫流速增加解吸率降低，因為流速過快，洗脫劑不能與花色苷充分作用而將其從樹脂上洗脫出來。同時，洗脫流速為1.5 BV/h和2 B/Uh時，都可獲得較高色價的花色苷色素，但是2 BV/h的洗脫流速解吸率偏低，所以選擇最佳洗脫流速為1.5 BV/h。
2.2.2.6洗脫劑乙醇質量分數(shù)對動態(tài)吸附的影響
圖7顯示，對于樹脂HPD 500，洗脫液中隨著乙醇質量分數(shù)的增加解吸率先增加后減小。乙醇質量分數(shù)分別為60%和70%時，紫甘藍花色苷解吸率均較高；同時，隨著乙醇質量分數(shù)的增加，純化后花色苷色價先增加后減小，在乙醇質量分數(shù)為60%時，純化后花色苷色價最大，純度最高。因此從經濟及純化角度考慮，選用質量分數(shù)為60%的酸性乙醇水溶液為解吸液最佳。
2.2.2.7最佳條件下純化結果
根據(jù)2.2.2.1～2.2.2.6得到HPD 500樹脂純化紫甘藍花色苷的最佳條件，如表4所示。
根據(jù)上述條件純化花色苷結果見表5，發(fā)現(xiàn)紫甘藍粗提液經過HPD 500樹脂的純化可以將色價從初始的2.3提高到47.8，為初始值的20.8倍。
3結論與討論
選用六種不同極性的大孔吸附樹脂對紫甘藍花色苷的靜態(tài)吸附進行考察，發(fā)現(xiàn)ADS17樹脂吸附率較低，將剩余的五種樹脂進行了對紫甘藍花色苷的動態(tài)吸附，其中HPD 500樹脂對紫甘藍花色苷純化效果最好。通過動態(tài)吸附最佳條件的研究表明，HPD 500純化花色苷的最佳條件為：上柱液吸光度0.707、上柱液體積1.5 BV、吸附流速1.5 BV/h、洗脫流速1.5 BV/h以及解吸液為質量分數(shù)60%的酸性乙醇(pH 2.5)，最佳條件下得花色苷色價為47.8，純度為原來的20.8倍；說明經HPD 500樹脂純化后，去除了大量雜質，提高了產品中花色苷類化合物的純度。
關于大孔樹脂純化某一類物質的傳統(tǒng)研究是將解吸率和吸附率作為樹脂的評價標準，而不考慮樹脂對所吸附物質的選擇性，試驗主要以色價為主要參考標準同時兼顧吸附率和解吸率來評價純化效果的標準，為紫甘藍花色苷純化及利用提供理論依據(jù)。
此外，整個試驗過程均采用無毒無害的試劑，適合在食品工業(yè)中應用。
