淺談維生素D減緩牙周炎癥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)
相關(guān)鏈接： 四川安全網(wǎng) 四川質(zhì)量網(wǎng) 四川論文網(wǎng) 四川資訊網(wǎng)
維生素D(vitamin D )為固醇類衍生物，具抗佝僂病作用，又稱抗佝僂病維生素。目前認(rèn)為維生素D也是一種類固醇激素，維生素D家族成員中最重要的成員是VD2(麥角鈣化醇)和VD3(膽鈣化醇)。維生素D均為不同的維生素D原經(jīng)紫外照射后的衍生物。植物不含維生素D，但維生素D原在動(dòng)、植物體內(nèi)都存在。維生素D是一種脂溶性維生素，有五種化合物，對(duì)健康關(guān)系較密切的是維生素D2和維生素D3。它們有以下三點(diǎn)特性：它存在于部分天然食物中;人體皮下儲(chǔ)存有從膽固醇生成的7-脫氫膽固醇，受紫外線的照射后，可轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素D3。適當(dāng)?shù)娜展庠∽阋詽M足人體對(duì)維生素D的需要。
摘要：目的：初步探討維生素D對(duì)牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用，為牙周病的防治提供一定的依據(jù)。方法：采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)、實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)維生素D對(duì)牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞分泌炎癥因子白介素1β、腫瘤壞死因子α水平的影響。結(jié)果：維生素D對(duì)牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞分泌炎癥因子白介素1β、腫瘤壞死因子α有顯著的抑制作用，最低有效濃度為6.25μg/ml，且隨著維生素D濃度的增加，抑制作用越明顯。結(jié)論：維生素D是一種潛在的防治牙周炎癥反應(yīng)的藥物。
關(guān)鍵詞：維生素D;1，25-二羥維生素D3;牙周炎;腫瘤壞死因子α;白介素1β
牙周炎是以炎癥因子滲出、牙周支持組織破環(huán)為主要病理表現(xiàn)的慢性、廣泛性炎癥反應(yīng)，是成人失牙的首要原因。已被醫(yī)學(xué)界定論為繼癌癥、心腦血管疾病之后，威脅人類身體健康的第三大殺手，也是口腔健康的“頭號(hào)殺手”。流行病學(xué)研究結(jié)果顯示牙周炎是加重心血管疾病、Ⅱ型糖尿病等多種系統(tǒng)性疾病進(jìn)程，影響預(yù)后的重要誘因[1]。發(fā)病機(jī)制與免疫、炎癥反應(yīng)密切相關(guān)�，F(xiàn)已證實(shí)革蘭氏陰性厭氧菌――牙齦卟啉單胞菌是慢性牙周炎發(fā)生、發(fā)展的主要病原菌，約占牙周炎患者95%以上的病變活動(dòng)區(qū)域[2]。牙齦卟啉單胞菌能利用多種毒力因子如半胱氨酸蛋白酶(常指牙齦素)、菌毛和脂多糖侵襲牙周組織和宿主免疫系統(tǒng)。維生素D是保持骨骼健康，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、炎癥反應(yīng)的重要元素，不僅與鈣吸收、破骨細(xì)胞活性密切相關(guān)，還參與調(diào)節(jié)基因表達(dá)、蛋白合成和免疫/炎癥反應(yīng)[3]。本實(shí)驗(yàn)的目的就是研究維生素D對(duì)牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響。
一、材料和方法
1.1 材料
維生素D代謝物1，25-二羥維生素D3[1，25(OH)2D3]購(gòu)自Sigma公司，牙齦卟啉單胞菌購(gòu)自四川大學(xué)口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。1，25-二羥維生素D3溶液的配置：將晶體用95%的乙醇配置成10mg/ml的母液，置于-20℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆�。使用時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成各種濃度梯度(100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.5625μg/ml)的工作液。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 實(shí)驗(yàn)菌液的準(zhǔn)備、細(xì)菌復(fù)蘇及培養(yǎng)：將牙齦卟啉單胞菌ATCC33277菌株復(fù)蘇并接種于含有20μM氯高鐵血紅素和0.0001%維生素K的Todd-Hewitt肉湯(THB-HK)中，在37℃厭氧環(huán)境下(CO2 10%、N2 90%)培養(yǎng)48h，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定后傳代培養(yǎng)24h，備用。
1.2.2 人牙周膜成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)：采取酶消化原代培養(yǎng)法。刮取臨床因正畸或阻生拔除牙齒的根中1/3的健康牙周膜，立即投入含三抗的D-Hanks內(nèi)。清洗刮取的牙周膜，去除血污及不需要組織。加入0.1%膠原酶37℃消化30min，加入含10%FBS的DMEM終止消化，二層無菌紗布濾除組織塊，1 000ppr 5min離心去上清，加入含10%FBS的DMEM進(jìn)行培養(yǎng)。4～8代用于實(shí)驗(yàn)。
1.2.3 維生素D對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞活性的影響：消化離心收集人牙周膜細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度為106/ml接種于96孔板中，培養(yǎng)2h待細(xì)胞貼壁后添加不同濃度的維生素D和厭氧培養(yǎng)了24h的牙齦卟啉單胞菌的菌液，繼續(xù)孵育72h。接著每孔添加10μl MTT溶液置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，再每孔添加100μl溶解溶液孵育過夜。最后使用分光光度儀進(jìn)行讀數(shù)。
1.2.4 牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)人牙周膜成纖維細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)：消化離心收集人牙周膜細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度為106/ml接種于24孔板中，培養(yǎng)過夜。次日，在孔板中添加200μl不同濃度的維生素D置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h。將厭氧培養(yǎng)了24h的牙齦卟啉單胞菌的菌液轉(zhuǎn)移至塑料離心管，10 000ppr，10min，4℃離心，棄上清液后用含1%FBS的DMEM清洗2次。測(cè) OD660，并根據(jù)孔板內(nèi)牙周膜細(xì)胞密度計(jì)算感染倍數(shù)(multiplicity of infection， MOI)為100時(shí)，所需細(xì)菌混懸液體積(OD660=1表明細(xì)菌密度為2.5×109/ml)。將感染倍數(shù)為100的菌液添加到孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集培養(yǎng)液置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肨rizol裂解細(xì)胞，酚/氯仿法提取細(xì)胞總RNA置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.5 ELISA檢測(cè)IL-1β、TNF-α蛋白的表達(dá)：按ELISA試劑盒產(chǎn)品說明書步驟操作：使用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，取反應(yīng)板加樣、并按說明依次加入一抗、酶標(biāo)抗體及底物工作液，最后加入反應(yīng)終止液，于酶標(biāo)儀以波長(zhǎng)450nm讀取各孔光密度值。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和ELISAcalc軟件計(jì)算各樣本含量。
1.2.6 qPCR檢測(cè)IL-1β、TNF-αmRNA的表達(dá)：提取的總RNA經(jīng)濃度測(cè)定、純度鑒定后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照反應(yīng)體系依次添加SYBR Green染料、引物、dNTP、cDNA、Taq酶及去離子水，配制PCR反應(yīng)溶液。置于Real-time PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃3min預(yù)變性，然后按照95℃30s變性，58℃1min退火，72℃1min，共40做個(gè)循環(huán)，最后72℃7min延伸。
二、結(jié)果
2.1 維生素D對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞活性的影響
如圖1所示：與空白對(duì)照組相比，牙齦卟啉單胞菌組牙周膜成纖維細(xì)胞的增殖被顯著抑制，當(dāng)維生素D濃度為3.125和6.25μg/ml時(shí)，牙齦卟啉單胞菌引起的細(xì)胞毒性作用非常顯著�？梢�，牙齦卟啉單胞菌顯著抑制人牙周膜成纖維細(xì)胞的增殖，當(dāng)維生素D濃度≥12.5μg/ml能減弱牙齦卟啉單胞菌引起的細(xì)胞毒性。單純的維生素D不影響人牙周膜成纖維細(xì)胞的活性。
2.2 維生素D對(duì)牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的IL-1β、TNF-α表達(dá)水平的影響
ELISA及qPCR檢測(cè)結(jié)果均顯示牙齦卟啉單胞菌顯著增加人牙周膜成纖維細(xì)胞分泌IL-1β和TNF-α，當(dāng)維生素D濃度≥6.25μg/ml時(shí)，能顯著抑制牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)的分泌(如圖2、3)。
三、討論
維生素D是由暴露于紫外線的皮膚合成或從日常飲食中直接獲取的開環(huán)甾類化合物。具有鈣化醇(維生素D2)和膽鈣化醇(維生素D3)兩種形式。這兩種形式的維生素均在肝臟代謝為25-羥基維生素D并在腎臟被1-羥化酶轉(zhuǎn)化為其活性形式1，25-二羥維生素D。因此本實(shí)驗(yàn)選取維生素D的活性形式作為研究試劑。
牙周炎伴隨的牙槽骨破壞主要起源于病原菌誘導(dǎo)的過強(qiáng)炎癥反應(yīng)。IL-1β和TNF-α是破骨細(xì)胞活化的主要因子。馬寧等人在大耳白兔牙周組織注射IL-1β、TNF-α，能成功建立典型而穩(wěn)定，近似臨床牙周炎表現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[4]。尹麗媛等采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)成人牙周炎患者牙齦組織中IL-1β、TNF-αmRNA表達(dá)水平的結(jié)果顯示：其在病變牙齦的表達(dá)強(qiáng)度顯著高于正常牙齦，因此推測(cè)IL-1β、TNF-α表達(dá)與牙周炎發(fā)病機(jī)理密切相關(guān)，有效抑制其分泌與合成有利于牙周炎的治療與預(yù)后[5]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示牙齦卟啉單胞菌能顯著增加人牙周膜細(xì)胞分泌、合成IL-1β和TNF-α，誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，能在細(xì)胞水平模擬牙周炎的病理狀態(tài)。
流行病學(xué)觀察顯示牙周健康與維生素D的攝入量密切相關(guān)。與每日攝入≥800IU的人群相比，攝入量≤400IU的人群更容易罹患重度牙周疾病并伴隨中重度的牙槽骨破壞[6]。25-羥基維生素D和1，25-二羥維生素D血清濃度偏低者牙周炎和牙喪失的發(fā)病率更高[7-8]。維生素D不僅能夠增加骨密度，抑制骨吸收，減少牙喪失[9- 10]，還能通過其抗炎活性發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[11-12]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也顯示1，25-二羥維生素D能顯著抑制牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的IL-1β和TNF-α的分泌。盡管大量研究顯示維生素D在保持骨密度，減少慢性炎癥疾病等方面作用顯著，但是維生素D缺乏和不足在人群中仍然廣泛存在。因此政府呼吁不同年齡段的人群每日口服維生素D 200-600IU[13]。此外，適當(dāng)日光浴、進(jìn)食富含維生素D的食物如魚肝油均是有效的途徑。
參考文獻(xiàn)：
[1]Zhang DH，Yuan QN，Zabala PM，et al.Diabetic and cardiovascular risk in patients diagnosed with periodontitis [J].Aust Dent J，2014，20.Epub ahead of print].
[2]Bostanci N，Belibasakis，GN.Porphyromonas gingivalis：an invasive and evasive opportunistic pathogen[J].FEMS Microbiol Lett，2012，333：1-9.
[3]Heaney RP. Vitamin D in health and disease[J].Clin J Am Soc Nephrol，2008，3(5)：1535-1541.
[4]馬寧，張穎麗，張莉，等.牙周炎動(dòng)物模型的研究[J].白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，27(6)：611-613.
[5]尹麗媛，李麗娜，潘亞萍，等.IL-1βmRNA，TNF-αmRNA在成人牙周炎患者牙齦組織中表達(dá)的研究[J].華西口腔醫(yī)學(xué)，2001，19(5)：318-321.
[6]Alshouibi EN，Kaye EK，Cabral HJ，et al.Vitamin D and periodontal health in older men[J].J Dent Res.2013;92(8)：689-693.
[7]Antonoglou GN， Knuuttila M，Niemel? O，et al.Low serum level of 1，25(OH)2 D is associated with chronic periodontitis[J].J Periodontal Res，2014，7.[Epub ahead of print].
[8]Jimenez M，Giovannucci E，Krall Kaye E，et al.Predicted vitamin D status and incidence of tooth loss and periodontitis[J].Public Health Nutr，2014，17(4)：844-852.
[9]Stein SH，Tipton DA.Vitamin D and its impact on oral health--an update[J].J Tenn Dent Assoc，2011，91(2)：30-33.
[10]Krall EA，Wehler C，Garcia RI，et al.Calcium and vitamin D supplements reduce tooth loss in the elderly[J].Am J Med， 2001，111(6)：452-456.
[11]Andrukhov O，Andrukhova O，Hulan U，et al.Both 25-hydroxyvitamin-D3 and 1，25-dihydroxyvitamin-D3 reduces inflammatory response in human periodontal ligament cells[J].PLoS One，2014，28，9(2)：e90301.
[12]Tang X，Pan Y，Zhao Y.Vitamin D inhibits the expression of interleukin-8 in human periodontal ligament cells stimulated with Porphyromonas gingivalis[J].Arch Oral Biol，2013，58(4)：397-407.
[13]Anand N，Chandrasekaran SC，Rajput NS.Vitamin D and periodontal health：Current concepts[J].J Indian Soc Periodontol，2013，17(3)：302-308.
