簡(jiǎn)述BHK—21細(xì)胞生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)參數(shù)
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摘要：使用國產(chǎn)BC-7L生物反應(yīng)器對(duì)BHK-21細(xì)胞懸浮培養(yǎng)參數(shù)進(jìn)行了初步研究。通過對(duì)培養(yǎng)液血清含量、pH、溶氧和攪拌轉(zhuǎn)速逐一進(jìn)行優(yōu)化研究，最終確定了BHK-21細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的最佳參數(shù)為：血清濃度為5%，pH為7.40、DO為50%，攪拌轉(zhuǎn)速為100r/min。 關(guān)鍵詞：生物反應(yīng)器；BHK-21細(xì)胞；懸浮培養(yǎng) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)在生物技術(shù)和生物醫(yī)藥研究中已得到了廣泛的應(yīng)用。近幾十年來，隨著生物工程和組織工程學(xué)的發(fā)展，相應(yīng)的生物反應(yīng)器水平也在不斷提高，現(xiàn)已研制出多種不同用途、型號(hào)的動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器，其性能也日趨完善，種類越來越多，規(guī)模越來越大，在國外，已放大到5000 -10000L。懸浮培養(yǎng)技術(shù)最大優(yōu)勢(shì)是通過更為精確有效的工藝控制手段，在獲得最大產(chǎn)量的同時(shí)能穩(wěn)步提高產(chǎn)品的質(zhì)量。由于動(dòng)物細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)過程中對(duì)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件要求很高，不易達(dá)到最佳生長狀態(tài)，故本研究對(duì)生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞的培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究，以期使BHK-21細(xì)胞達(dá)到最佳生長狀態(tài)，為后續(xù)規(guī)�；a(chǎn)提供參考。 1 材料和方法 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 BHK-21細(xì)胞，新生牛血清（四季青），DMEM（GBICO），NaHC03，消泡劑。 1.2 儀器設(shè)備 BC-7L生物反應(yīng)器，為廣州齊志生物工程設(shè)備有限公司產(chǎn)品。 1.3 實(shí)驗(yàn)方法 1.3.1 BHK-21懸浮細(xì)胞制備取BHK-21貼壁細(xì)胞種進(jìn)行復(fù)蘇，待細(xì)胞長滿單層并生長狀態(tài)良好時(shí)，用0.25%胰酶消化，之后用移液管輕輕吹打成單個(gè)細(xì)胞懸浮液，以0.5×106個(gè)/mL的密度接種300-1000mL搖瓶中，于90r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)5代后，進(jìn)行上罐培養(yǎng)。 1.3.2 血清含量對(duì)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的影響將搖瓶BHK-21細(xì)胞以0.5×106個(gè)/mL的密度接種至5生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中血清含量分別調(diào)整2%、5%、10%三個(gè)濃度進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中對(duì)各濃度細(xì)胞取樣計(jì)細(xì)胞數(shù)并觀察細(xì)胞形態(tài)。 1.3.3 培養(yǎng)液pH對(duì)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的影響在保持其它培養(yǎng)條件不變的情況下，分別設(shè)置DMEM培養(yǎng)液pH為7.0-7.2、7.2-7.4、7.4-7.6、7.6-7.8進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。37℃培養(yǎng)48h后，取樣進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并觀察細(xì)胞形態(tài)。 1.3.4 培養(yǎng)液溶氧（DO）對(duì)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的影響在保持其它參數(shù)不改變的情況下，分別設(shè)置溶氧為40%、50%、60%、70%、80%，同樣培養(yǎng)48h后取樣計(jì)細(xì)胞數(shù)并觀察細(xì)胞形態(tài)。 1.3.5 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的影響在同樣其它的參數(shù)條件下，只通過改變攪拌的轉(zhuǎn)速來觀察，轉(zhuǎn)速對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響。分別設(shè)置轉(zhuǎn)速為40r/min、70r/min、100r/min。 2 結(jié)果 2.1 血清含量對(duì)懸浮BHK-21生長的影響 對(duì)三個(gè)血清濃度下培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行取樣觀察和細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示：2%血清濃度下，細(xì)胞生長極其緩慢，細(xì)胞密度顯著低于另外兩組；血清濃度為5%時(shí)，細(xì)胞生長良好，細(xì)胞密度顯著高于2%組，但略低于10%血清濃度；10%血清濃度組，細(xì)胞生長好，細(xì)胞數(shù)最多。 2.2 培養(yǎng)液pH對(duì)懸浮BHK-21生長的影響 pH在一定小范圍內(nèi)變化，對(duì)細(xì)胞生長并不會(huì)產(chǎn)生大的影響，但如果變動(dòng)幅度較大，則會(huì)造成細(xì)胞生長緩慢，狀態(tài)不好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示pH為7.4時(shí)，細(xì)胞生長最佳。 2.3 DO對(duì)懸浮BHK-21生長的影響 溶氧低，不足以維持細(xì)胞生長，溶氧高會(huì)增加02通入量，造成生產(chǎn)成本提高。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，50%的溶氧效果最好。 2.4 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)BHK-21生長的影響 40r/min條件下，轉(zhuǎn)速不足以提供足夠的力量使細(xì)胞懸浮起來，觀察到反應(yīng)器底部沉積了較多的細(xì)胞；將轉(zhuǎn)速提高至70r/min，細(xì)胞雖然不會(huì)再沉積到反應(yīng)器底部，但是取樣觀察發(fā)現(xiàn)有較多的細(xì)胞聚集成團(tuán)；繼續(xù)提高轉(zhuǎn)速至100r/min，細(xì)胞聚團(tuán)情況得到解決，細(xì)咆生長良好。100r/min為最佳攪拌轉(zhuǎn)速。 3 結(jié)論與分析 1）實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)搖瓶轉(zhuǎn)接生物反應(yīng)器的時(shí)候，細(xì)胞密度不可過低，從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，如果當(dāng)細(xì)胞密度低于2×105個(gè)/mL時(shí)，細(xì)胞生長則十分緩慢，有資料顯示如果培養(yǎng)基與細(xì)胞的容積比例大于2000：1，生長物質(zhì)彌散到細(xì)胞外過多，將使細(xì)胞內(nèi)濃度低于最小限度的濃度，此時(shí)細(xì)胞不能再增殖，培養(yǎng)基的pH值變堿，抑制細(xì)胞生長，甚至引起細(xì)胞死亡等。 2）雖然血清濃度為10%時(shí)，細(xì)胞數(shù)高、狀態(tài)好，但是與血清濃度為5%時(shí)相比，差異并不太大，綜合考慮生產(chǎn)成本，應(yīng)選擇血清濃度為5%為最佳血清濃度。另外，所使用的血清質(zhì)量也會(huì)影響細(xì)胞的生長狀態(tài)，一般質(zhì)量較好的血清在融化后呈透明、淡黃色，并且無支原體、病毒及其它微生物污染。血清濃度高有利于細(xì)胞分裂，細(xì)胞生長較快，但是高濃度的血清成分比較復(fù)雜，對(duì)后續(xù)的純化不利，且價(jià)格較高，質(zhì)量不穩(wěn)定，因此選擇開發(fā)和使用低血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基成為未來的需求。 3）細(xì)胞聚集成團(tuán)對(duì)細(xì)胞生長狀態(tài)具有嚴(yán)重影響。如果結(jié)團(tuán)嚴(yán)重，處于細(xì)胞團(tuán)中間的細(xì)胞則會(huì)吸收營養(yǎng)物質(zhì)不足，生長速度降低，從而引起細(xì)胞蛋白結(jié)構(gòu)改變等一系列問題，使得細(xì)胞表達(dá)能力下降。一方面，提高攪拌速度可以改善細(xì)胞結(jié)團(tuán)的情況，但較高的攪拌速度也會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的影響，如果可以開發(fā)一種抑制細(xì)胞結(jié)團(tuán)的試劑，勢(shì)必將大大促進(jìn)懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)。
