91精品人妻互换日韩精品久久影视|又粗又大的网站激情文学制服91|亚州A∨无码片中文字慕鲁丝片区|jizz中国无码91麻豆精品福利|午夜成人AA婷婷五月天精品|素人AV在线国产高清不卡片|尤物精品视频影院91日韩|亚洲精品18国产精品闷骚

論文導(dǎo)讀:：株腫瘤細(xì)胞總RNA的提取結(jié)果�；�因至少存在7個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄本（轉(zhuǎn)錄本A-G）。
論文關(guān)鍵詞：腫瘤細(xì)胞，RASSF1基因家族，轉(zhuǎn)錄，RAS家族

　　近年來較多研究都發(fā)現(xiàn)染色體3P21.3等位缺失在肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、腎癌等常見腫瘤中頻繁發(fā)生，推測(cè)該位點(diǎn)可能存在一個(gè)或多個(gè)腫瘤抑制基因。2000年，Dammnn等 [1]利用酵母雙雜交篩選的方法從3P21.3內(nèi)120 kb長最小純合缺失區(qū)分離出一種能與DNA修復(fù)蛋白XPA相互作用的基因，由于其核苷酸序列的碳端(C-terminus)與小鼠RAS相關(guān)區(qū)域家族1（RAS association domainfamily 1）與小鼠RAS效應(yīng)蛋白Nore1高度同源，遂命名為RAS相關(guān)區(qū)域家族1，即RASSF1基因。由于選擇性剪切和不同啟動(dòng)子的使用，RASSF1基因至少存在7個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄本（轉(zhuǎn)錄本A-G）。有研究發(fā)現(xiàn)RASSF1能直接參與細(xì)胞周期的調(diào)控醫(yī)學(xué)論文，在體內(nèi)和體外能抑制細(xì)胞生長，并參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2]。
　　最新研究進(jìn)展揭示，抑癌基因功能的抑制或失活，除了與基因段的丟失，DNA核苷酸序列的錯(cuò)位、缺失、重組、變換、點(diǎn)突變等機(jī)制相關(guān)外，還與抑癌基因DNA核苷酸序列中的胞嘧啶核苷酸（C）和鳥嘌呤核苷酸（G）二聯(lián)連結(jié)中（CpG）的胞嘧啶堿基環(huán)中的第5位碳原子上所發(fā)生的甲基化具有極其重要的相關(guān)性[4]。抑癌基因R ASSF1的表達(dá)作用機(jī)制已經(jīng)初步明確,但其轉(zhuǎn)錄本基因在惡性腫瘤中的作用研究較少，尤其是RASSF1B,RASSFIF在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)比較還未見相關(guān)報(bào)道。本文旨在通過RT-PCR的方法，檢測(cè)五種常見的腫瘤細(xì)胞中RASSF1家族中RASSF1B,RASSF1F不同轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)情況，為基因治療提供理論基礎(chǔ)。
　　1 試驗(yàn)材料與方法
　　1.1 試驗(yàn)材料
　　5株腫瘤細(xì)胞AGS（胃腺癌）、95D（高轉(zhuǎn)移肺癌）、LTEP-a-2（肺腺癌）、HEPG2(肝癌)和U937（白血病細(xì)胞）購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫；MMLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Promega公司。
　　1.2細(xì)胞培養(yǎng)
　　試驗(yàn)所選用的五種腫瘤細(xì)胞用DMEM(Invitrogen)加10 %小牛血清，CO2培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)至細(xì)胞均勻覆蓋細(xì)胞瓶約3/4。
　　1.3cDNA的制備
　　以Trizol提取的方法提取細(xì)胞總RNA并純化, 用MMLV反轉(zhuǎn)錄得到五種腫瘤細(xì)胞的cDNA。
　　1.4 RT-PCR
　　利用DNAstar軟件設(shè)計(jì)RASSF1家族兩種轉(zhuǎn)錄本的特異引物，以人β－actin為內(nèi)參，通過RT-PCR方法檢測(cè)這兩種轉(zhuǎn)錄本在五種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況論文的格式。引物序列見表1。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，94 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s 醫(yī)學(xué)論文，72 ℃ 1.5 min 30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
　　1.5 應(yīng)用生物信息學(xué)軟件分析7種轉(zhuǎn)錄本的剪切方式。
　　2 結(jié)果
　　2.1 兩種轉(zhuǎn)錄本的讀碼框結(jié)構(gòu)的比較
　　表1 擴(kuò)增RASSF1的兩種轉(zhuǎn)錄本的引物設(shè)計(jì)
　　

根據(jù)GenBank中搜索的結(jié)果，通過公布的2種RASSF1的異構(gòu)體。其中,兩種轉(zhuǎn)錄本主要的差別在于中部存在少數(shù)氨基酸的不同剪接方式。RASSF1B為N端缺失，RASSF1F缺失了C端的大部分氨基酸（見圖1和表1）。
　　
　　圖1 RASSF1的7種轉(zhuǎn)錄本的氨基酸結(jié)構(gòu)示意圖。(其中B,F分別表示RASSF1B,RSSF1F)
　　代表各自特異的氨基酸序列；結(jié)構(gòu)框上端的數(shù)字代表發(fā)生變異的氨基酸位點(diǎn)，最后的數(shù)字為其讀碼框的長度；交叉線代表缺失的氨基酸，下端的數(shù)字為缺失的氨基酸數(shù)目。
　　2.2 5株腫瘤細(xì)胞總RNA的提取結(jié)果
　　提取了5株腫瘤細(xì)胞的總RNA。凝膠電泳的結(jié)果顯示，28S和18S條帶較為明顯， RNA的完整性和質(zhì)量較好（見圖2）。為進(jìn)一步證實(shí)，采用核酸檢測(cè)儀（Gene Spec III）檢測(cè)，A260/A280值均在1.9 –2.0之間，其結(jié)果與電泳的結(jié)果一致，各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到反轉(zhuǎn)錄要求。
　　
　　圖2 瓊脂糖電泳檢測(cè)總RNA
　　2.3 2種轉(zhuǎn)錄本在5種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)狀況
　　以5株腫瘤細(xì)胞反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)上述2種轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)狀況（見圖3）。轉(zhuǎn)錄本B和F在AGS（胃腺癌）腫瘤細(xì)胞中均未見表達(dá)。而其他轉(zhuǎn)錄本在腫瘤中的轉(zhuǎn)錄有差別，轉(zhuǎn)錄本B和F在95D（高轉(zhuǎn)移肺癌）細(xì)胞中均有表達(dá)醫(yī)學(xué)論文，表達(dá)的強(qiáng)度差別不大，在LTEP-a-2（肺腺癌）、HEPG2(肝癌)細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄本B表達(dá)較高，而轉(zhuǎn)錄本F在此兩種腫瘤細(xì)胞中未見表達(dá)或表達(dá)量很低,轉(zhuǎn)錄本B和F白血病細(xì)胞U937中有轉(zhuǎn)錄。且轉(zhuǎn)錄本B表達(dá)強(qiáng)度較大.從細(xì)胞系分析，在此實(shí)驗(yàn)中胃癌細(xì)胞AGS幾乎沒有RASSF1B,RASSF1F的轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象。提示2種類型轉(zhuǎn)錄本可能與胃癌發(fā)生呈負(fù)相關(guān)。在肝癌和肺癌中2種轉(zhuǎn)錄本基因表達(dá)結(jié)果完全不同,所起的作用可能不同.
　　
　　圖3 2種轉(zhuǎn)錄本在不同腫瘤細(xì)胞系中的PCR擴(kuò)增比較
　　細(xì)胞：A，AGS；D，95D；H，HEPG2；L，LTEP-a-2；U，U937； B－F表示RASSF1的各種異構(gòu)體，±表示微量擴(kuò)增，- 表示陰性，+ 表示陽性。
　　3 討論
　　RASSF1B是Ras家族相關(guān)的基因主要轉(zhuǎn)錄本之一,其編碼三個(gè)結(jié)構(gòu)域依次為1β、2αβ和外顯子3—6的cDNA全長為1664bp，包含外顯子2γ和外顯子3—6，只編碼RAS相關(guān)區(qū)域。其生物學(xué)功能在進(jìn)研究中,在研究中發(fā)現(xiàn)該基因含有一個(gè)Ras結(jié)合區(qū)域和一個(gè)SARAH區(qū)域。Ras區(qū)域是該家族共有的區(qū)域。而RAS通路是所有細(xì)胞都具有的一條高度保守的信號(hào)傳遞通路論文的格式。蛋白在有活性的GTP結(jié)合構(gòu)象和無活性GDP的結(jié)合構(gòu)象之間轉(zhuǎn)化, 通過與不同的效應(yīng)物分子激活多條信號(hào)傳遞通路”有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道醫(yī)學(xué)論文，RASSF1B是通過該區(qū)域以GTP方式直接與Ha-Ras相結(jié)合[3]。而SARAH區(qū)域可以調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[11]。其機(jī)制可能與以下途徑有關(guān)：(1) 活化的Ras蛋白具有促進(jìn)生長增殖的作用，RASSF1基因可能通過抑制了Ras的激活途徑而抑制生長、促進(jìn)細(xì)胞凋亡；(2) RASSF1能通過阻斷CyclinD1的積累及細(xì)胞周期G1/S期的進(jìn)展而一步抑制腫瘤生長［4］。 RASSFIF是RASSF1基因家族中研究較少的轉(zhuǎn)錄本基因,僅在部分腫瘤細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn),現(xiàn)已明確部分RASSF1基因家族失活主要機(jī)制是由于啟動(dòng)子區(qū)5′CpG島的異常高甲基化所致 RASSF1家族高甲基化能通過DNA自身化學(xué)修飾方式而抑制RASSF1基因家族的轉(zhuǎn)錄使其表達(dá)缺失，喪失了負(fù)性調(diào)控細(xì)胞周期的功能，使細(xì)胞易于發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［5］。目前關(guān)于RASSF1F基因在正常組織及腫瘤組織中表達(dá)情況及生物學(xué)功能研究還未見報(bào)道。
　　目前已發(fā)現(xiàn)的各轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)分析，B和F型是較主要的轉(zhuǎn)錄本。該類型則可能是由基因突變所致。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RT-PCR的方法，檢測(cè)5種腫瘤細(xì)胞中RASSF1家族中2種不同轉(zhuǎn)錄本mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果表明，2種各轉(zhuǎn)錄本基因不僅是在不同腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)有較大差異。而且在相同腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平并不完全相同.由此提示可能腫瘤細(xì)胞存在該類基因的突變，同時(shí)說明這2種轉(zhuǎn)錄本基因可能與抑癌有關(guān)。但至于該基因家族7種轉(zhuǎn)錄本基因在同一腫瘤細(xì)胞中哪一種起主要作用,則需進(jìn)一步通過基因表達(dá)的方法，提高各轉(zhuǎn)錄本基因的表達(dá)，可能獲得更直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。相關(guān)研究正在進(jìn)行之中。
　　［1］Dammann R, Li C, Yoon JH, et al. Epigeneticinactivation of a ras association domain family protein from the lung tumorsuppressor locus 3p21.3［J］. NatGenet, 2000; 25(3):315-319.
　�。�2］Shivakumar L, Minna J,Sakamaki T, et al. The RASSF1A tumor suppressor blocks cell cycle progressionand inhibits cyclinD1 accumulation［J］. Mol Cell Biol, 2002; 22(12):4309-4318.
　　［3］Newton AC.Seeing twodomains.Curr Biol,1955.5;973.976
　�。�4］Hallberg B,Hayter SI,Downward J.Interaction ofRas and Raf in infect wammalian cells upon extracellular. J BiolChen,1994,269:3913-3916
　�。�5］Whang-peng J, Kao SC, LeeEC, et a1. A specific chromosome defect associated with human small-cell lung cancendeletion3pl4-23[J]. Science, 1982, 215:181-182.