采用離液體雙水相萃取高效液相法檢測青霉素G的方法
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作者：張毅
離子液體雙水相萃取技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項環(huán)保、可操作性高以及萃取效率高的新型液液萃取技術(shù)，引起了世界各國的研究學(xué)者的廣泛關(guān)注。
2003年，首先報道了向親水性離子液體中加入磷酸鉀水溶液可以形成雙水相體系的現(xiàn)象并將之用于分離過程。該雙水相體系是由一種有機鹽（親水性離子液體）和一種無機鹽（磷酸鹽）形成，不同于傳統(tǒng)意義的雙水相體系。2005年，在室溫下用[Omim]BF4/NaH2PO4雙水相提取阿莫西林和氨芐青霉素，比較了不同pH對分配系數(shù)的影響。結(jié)果表明，離子液體與抗生素分子間的靜電相互作用對抗生素在雙水相中的分配系數(shù)有重要影響，抗生素的分
子結(jié)構(gòu)也影響其在離子液體中的溶解度。運用親水性離子液體從發(fā)酵液中提取青霉素G后，用疏水性離子液體[Bminm]PF6對富離子液體相進行了二次萃取，將青霉素G回收到水相中，以此實現(xiàn)離子液體與青霉素的分離，既避免了出現(xiàn)有機溶劑體系中的蛋白乳化現(xiàn)象又解決了混合離子液體雙水相體系中的反萃問題，但試驗過程比較復(fù)雜且要嚴(yán)格控制體系的pH，否則青霉素G很容易降解從而影響萃取率的富集效果。
2005年，[Bmim]BF4/NaH2PO4雙水相體系分離了青霉素G鉀鹽，考察了離子液體用量、青霉素濃度以及NaH2PO4濃度對雙水相形成和萃取率的影響，試驗中青霉素G的濃度過高，且青霉素G易受pH的影響發(fā)生降解。試驗采用[Bmim]BF4/(NH4)2SO4雙水相體系萃取柱前衍生的青霉素G，并結(jié)合高效液相色譜測定。此法操作簡便、檢測成本低、適用pH范圍寬，明顯地提高了靈敏度，且有效地避開了離子液體對青霉素G檢測的干擾。通過改變離子液體雙水相的組成濃度，能夠得到較高的萃取率，從而達(dá)到很好的富集萃取效果。
1 材料與方法
1.1主要材料、儀器及設(shè)備
青霉素G鉀標(biāo)準(zhǔn)品，德國Dr. Ehrenstorfer公司；乙腈色譜純，迪馬科技有限公司；1，2，4-三唑，硫酸氫化四丁基銨，氯化汞，薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司；無水磷酸氫二鈉，二水磷酸二氫鈉，五水硫代硫酸鈉，天津博迪化工股份有限公司；[Bmim]BF4，上海成捷化學(xué)有限公司；硫酸銨，西隴化工股份有限公司；試驗用水均為哇哈哈純凈水。
Agilent1200型高效液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；二極管陣列檢測器( DAD)；色譜柱Agilent-C18（4.6 mm×150 mm，5μm）：美國安捷倫公司；雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；低速離心機：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。
1.2試驗方法
1.2.1色譜條件
流動相：A:無水磷酸氫二鈉5g，二水磷酸二氫鈉10 g，五水硫代硫酸鈉4g，硫酸氫化四丁基銨6.5g，用水定容至1 000 m L;B：乙腈（過膜超聲備用）。
色譜柱：Agilent-C18（4.6 mm×150 mm，5μm）；檢測波長：325 nm;流動相A:流動相B=65：35;檢測波長：325 nm;流速：1.00 m L/min;進樣量：20μL。
1.2.2標(biāo)準(zhǔn)儲備液配置
準(zhǔn)確稱取10 mg青霉素G標(biāo)準(zhǔn)品用水溶解，定容至10 m L，-20℃避光保存，有效期1個月。
1.2.3青霉素G標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。
取一定量1.2.2中配置的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別制備100，200，300，400和500μg/m L青霉素G的標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)過衍生后，在1.2.1色譜條件下進行檢測，以峰面積(y)對青霉素G的濃度進行線性回歸分析，即得青霉素G的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。
1.2.4離子液體雙水相萃取體系的制備
在10 m L玻璃離心管中加入一定量的離子液體[Bmim]BF4及一定量的(NH4)2SO4，加入1 m L已知濃度的按照國標(biāo)法{汀生后的青霉素G，加水定容至10 m L( 10 g)，震蕩至無機鹽全部溶解，低速離心機2 500r/min離心15 min，分層后取上相過0.45μm的有機膜，進樣20μl，液相檢測。
1.2.5 離子液體雙水相體系萃取能力測定
按1.2.4所述方法配制雙水相體系10 m L( 10 g)，分相后記錄上、下相體積（VIL，Vs，用公式(1)計算系統(tǒng)的相比JR和回收率Y。
式中：C0、V0分別為加入雙水相體系中青霉素的原始濃度及體積；CIL為離子液體相中青霉素G的濃度。
2結(jié)果與討論
2.1最佳檢測波長的選擇
試驗通過紫外光譜儀確定物質(zhì)在紫外區(qū)檢測的最佳波長，分別對青霉素G（圖1A）、衍生后的青霉素G（圖1B）、[Bmim]BF4（圖1C）和衍生后的青霉素G+[Bmim]BF4（圖1D）在200～600 nm范圍內(nèi)進行全波長掃描。
從圖1A和圖1B中可以看出，衍生后的青霉素G在紫外區(qū)吸收明顯加強，吸收波長為325 nm，這與國標(biāo)法檢測青霉素G的波長相吻合。青霉素G吸收主要集中在200～280 nm之間。試驗可知，青霉素G經(jīng)液相檢測的吸收波長為225 nm．然而圖1C中離子液體的吸收也集中在這一波長范圍內(nèi)，說明離子液體會對青霉素G檢測有很大的干擾二從圖1D中可以得出，衍生后的青霉素G吸收波長從225 nm紅移到325 nm，靈敏度變高并發(fā)生了增色效用，可以有效地避免離子液體的干擾。
2.2高效液相色譜分析
試驗通過高效液相色譜儀對離子液體雙水相萃取青霉素G在波長225 nm下進行檢測，對衍生后的青霉素G在325 nm下進行檢測。如圖2E所示，在225 nm下，離子液體與青霉素的吸收相近，分離效果不佳；如圖2F所示，衍生后的青霉素C的出峰時間為13.458min，能夠很好地與離子液體分離，且提高了檢測的靈敏度，避開了離子液體吸收的干擾。
2.3青霉素G的標(biāo)準(zhǔn)曲線
以青霉素G的質(zhì)量濃度對峰面積作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到青霉素G標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：Y=61.842X-2 030.8．R2=0.998 9，線性范圍為100～500 μg/m L，青霉素G的質(zhì)量濃度與峰面積之間具有良好的線性關(guān)系。以10倍信噪比（S/）計算該方法的定量下限( LOQ)為97μg/m L，以3倍信噪比（S/N）計算該方法的檢出限( LOD)為29.1μg /m L。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算青霉素G含量，進而計算離子液體雙水相對青霉素G的萃取率。
2.4 (NH4)2S04的量對雙水相體系萃取青霉素G的影響
按1.2.4所述方法配制雙水相體系10 m L，體系中加入2 m L [Bmim]BF4，10mL已知濃度的青霉素G，再加入不同質(zhì)量的(NH4)2SO4，用水定容到10 m L。充分震蕩溶解后逐漸分層，離心后形成雙水相體系。取上相過膜進液相檢測，每個樣品檢測6次。試驗結(jié)果見表1。
從表1可知，體系的相比R隨著(NH4)2SO4的濃度增加而增大，當(dāng)體系中(NH4)2SO4的濃度到達(dá)24.72%時，上相體積不再增加，相比剛保持不變。隨著體系中(NH4)2SO4濃度的增大，[Bmim]BF4的疏水性增強，離子液體逐漸從鹽水溶液中分離出來。最后，當(dāng)鹽接近飽和時，幾乎沒有水分配到上相中，最終上相的體積接近于體系中[Bmim]BF4加入的初始體積。
由圖3可以看出，隨著體系中(NH4)2SO4的濃度增加萃取率也隨之增大，當(dāng)體系中(NH4)2SO4的濃度到達(dá)33.11%時，萃取率最高達(dá)到85.41%±1.88%，而后下降。這是由于當(dāng)體系中鹽濃度不高時，鹽析效應(yīng)起主導(dǎo)作用，致使青霉素G分配到上相離子液體中的量增加。當(dāng)體系中(NH4)2SO4的量繼續(xù)增加到34.13%時，鹽的濃度接近飽和，(NH4)2SO4的離子強度影響使[Bmim]BF4與青霉素G之間空間排斥作用以及離子之間的靜電力增大，使得青霉素的萃取率有所下降。
2.5 [Bmim]BF4的量對雙水相體系萃取青霉素G的影響
在10 m L玻璃離心管中加入3 g(NH4)2SO4，1 m L已知濃度的青霉素G，加入不同質(zhì)量的[Bmim]BF4，最后加水定量到10 g，使體系中(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%。
從表2可知，相比R隨著體系中[Bmim]BF4濃度的增加而增大，是由于在固定10 g的體系中，[Bmim]BF4加入的質(zhì)量增加，加入水的量就會減少，水分配在離子液體相中的量減少。當(dāng)體系中的鹽接近飽和時，上相的體積約等于[Bmim]BF4加人體系的初始體積，所以[Bmim]BF4的量增加，上相體積也增加，相比R增大，相比R會隨著離子液體加入量的增加而增加，但萃取率不會因相比的增加而一直增大，綜合表1和表2可以得出結(jié)論：相比R取決于離子液體雙水相的組成濃度，但并不是直接影響萃取率的因素。
由圖4可以看出，隨著[Bmim]BF4濃度的增加，萃取率逐漸增加，當(dāng)[Bmim]BF4的濃度達(dá)到30%時，萃取率最高達(dá)到93.21%±1.32%。，隨著離子液體濃度的增加，離子液體的疏水
性增強，而青霉素G易溶于親水性的環(huán)境里，所以當(dāng)[Bmim]BF4的濃度繼續(xù)增加超過35%時，萃取率有所下降。通過兩組試驗得出，萃取的最佳參數(shù)為(NH4)2SO424.72%.33.11%、[Bmim]BF4 30%。
2.6 回收率和精密度試驗
用[Bmim]BF4質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%/(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%雙水相體系對加標(biāo)100，200和400 μg/m L青霉素G的水溶液進行萃取，每個水平重復(fù)6次，結(jié)果見表3，回收率為81.37%～92.53%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.86%~2.25%。表明方法可靠，重現(xiàn)性較好。
3結(jié)論
試驗建立了離子液體雙水相萃取柱前衍生結(jié)合高效液相色譜測定青霉素G的新方法，在前人研究的離子液體雙水相萃取的基礎(chǔ)上降低了青霉素G的檢測濃度，經(jīng)過柱前衍生化提高了檢測的靈敏度，避開了離子液體對青霉素G檢測的影響，并討論了影響離子液體雙水相成相的規(guī)律。當(dāng)(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到24.72%～33.11%、[Bmim]BF4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到30%時，萃取率可達(dá)到93.21%±1.32%．方法可靠，靈敏度高，可以避免酸堿體系對青霉素G的降解問題影響其萃取率。[Bmim]BF4/(NH4)2SO4是一個可以有效萃取青霉素G的離子液體雙水相體系，具有較高的實用價值，有望為食品、藥品中痕量青霉素類抗生素的分離富集及檢測提供重要的參考價值。
4摘要建立了離子液體雙水相萃取結(jié)合柱前衍生測定青霉素CJ的檢測方法。由離子液體1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽[Bmim]BF4和(NH4)2SO4構(gòu)成離子液體雙水相體系萃取衍生后的青霉素G，并采用高效液相色譜對其進行檢測�？疾炝穗x子液體與鹽不同濃度組成對萃取效率的影響。結(jié)果表明，萃取率受[Bmim]BF4和(NH4)2SO4的濃度影響，當(dāng)體系中[Bmim]BF4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到-30%、(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在24.72%～33.11%之間時，萃取率可達(dá)到93.21%±1.42%(n=6)，定量下限(LOQ)為97μg /m L。這一體系能夠有效地萃取并檢測青霉素G，具有很高的靈敏度和萃取率。
