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作者：張毅             

  臭李子8～9月果實成熟時采收，鮮用或微火烘干。臭李子種子含油38.79%，可提煉工業(yè)用油；葉入藥，起鎮(zhèn)咳作用；葉中的揮發(fā)油，有殺蟲作用。臭李子含有單寧。單寧具有多種功用，能與金屬離子螯合，并能與自由基發(fā)生反應(yīng)，從而表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗氧化能力，同時還具有抗菌、抗病毒活性以及抗腫瘤活性，應(yīng)用十分廣泛。

  目前常用水和乙醇、甲醇、丙酮等有機(jī)溶劑來提取單寧，有機(jī)溶劑能促進(jìn)氫鍵斷裂，易于游離到胞外，從而萃取到溶劑中，提取的方式多采用水煎煮或水浴加熱。超聲波具有空化、微射流及微聲流等多級物理效應(yīng)，能促使植物細(xì)胞組織破壁或變形而應(yīng)用于一些油料、多酚等天然產(chǎn)物的提取，并取得了良好的效果。試驗采用超聲波輔助手段提取臭李子中單寧，并采用響應(yīng)面法對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以獲取最佳的提取工藝。

1  材料與方法

1.1材料與儀器

  臭李子購于長白山，鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰、溴水、無水碳酸鈉、水合沒食子酸均為分析純。

  UV2300紫外分光光度計：上海天美科學(xué)儀器有限公司；TB-214電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；XMTD-4000電熱恒溫水浴鍋：北京市永先明醫(yī)療儀器廠；TGL-16G高速臺式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2試驗方法

1.2.1單寧含量的測定

1.2.1.1原理

  以沒食子酸為主的單寧類化合物可將鎢鉬酸還原成藍(lán)色化合物，該化合物在765 nm處有最大吸收峰，其吸收值與單寧含量成正比，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

1.2.1.2試劑的配置

  1)鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液：稱取50.0 g鎢酸鈉，12.5 g鉬酸鈉，用350 m L水溶解到1000 m L回流瓶中，加入25 m L磷酸，50 m L鹽酸，充分混勻，小火加熱回流2h，再加入75 g硫酸鋰，25 m L蒸餾水，數(shù)滴溴水，然后繼續(xù)沸騰15 min（至溴水完全揮發(fā)為止），冷卻后，轉(zhuǎn)入500 m L容量瓶中定容，過濾，置棕色瓶中保存，使用時稀釋一倍。

  2) 75 g/L碳酸鈉溶液：稱取37.5無水碳酸鈉溶于250 m L溫水中，混勻，冷卻，稀釋至500 m L，過濾到儲備瓶中備用。

  3)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取0.110 0 g水合沒食子酸，溶解并定容至100 m L，此溶液沒食子酸質(zhì)量濃度為1 000 mg/L。在冰箱2℃~3℃下可保存5d。

  4)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)使用液：分別吸取1 000 mg/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 m L至100 m L容量瓶中，定容，溶解質(zhì)量濃度為0.0，10.0，20.0, 30.0, 40.0和50.0 mg/L.

1.2.1.3樣品預(yù)處理

  樣品解凍后，精確稱取樣品2g，清洗除籽后，超聲波法輔助提取臭李子中單寧，吸取2.0 m L樣品提取，8 000 r/min離心4 min，上清液備用。

1.2.1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

  吸取0.00，10.0，20.0，30.0，40.0和50.0 mg/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)使用液各1.0 m L，分別加5.0 m L的水，1.0 m L鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液3.0 m L碳酸鈉溶液，混勻，放置2h，以標(biāo)準(zhǔn)曲線0.0 mg/L為空白，在765 nm波長下測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.5樣品的測定

  吸取1.0 m L樣品提取液，分別加入5.0 m L水，1.0mL鎢酸鈉-鉬酸鈉混合液和3.0 m L碳酸鈉溶液，顯色，放置2h，以不加樣品提取液為空白，在765 nm波長下測定樣品溶液的吸光度。

1.2.1.6結(jié)果計算

  試樣中單寧（以沒食子酸計）提取量按式(1)進(jìn)行計算。

  式中：Y-試料中單寧含量，mg/kg; p-試樣測定液中沒食子酸的濃度，mg/L; 10-試樣測定液定容體積，m L; A-樣品稀釋倍數(shù)；m-試料質(zhì)量，g。

1.2.2提取溶劑的選擇

  在探索性試驗中以水，乙醇和丙酮水溶液為提取溶劑，對這3種常用溶劑的提取效果進(jìn)行比較，以提取溫度為50℃，時間80 min，料液比1：12(g／m L)，超聲波功率40 W。選擇50%乙醇和50%丙酮為溶劑，單寧提取量分別為192.45 mg/kg和209.73 mg/kg，而以水為溶劑的單寧提取量僅為172.18 mg/kg。由此可見，選擇丙酮作為最佳的提取劑。

1.2.3單因素試驗

  以丙酮作為提取溶劑，探討提取溶劑的濃度，超聲波功率，處理溫度和處理時間等因素對臭李子中單寧提取效果的影響。

  提取時間80 min，溫度50℃，超聲波功率40 W，用濃度為30%，45%, 60%, 75%和90%的丙酮溶液作為提取液，研究不同濃度溶劑對臭李子中單寧提取效果的影響；提取時間80 min，丙酮溶液的濃度為60%，超聲波功率40 W，選擇30℃，40℃，50℃，60 ℃和70 ℃五個溫度梯度進(jìn)行試驗，研究不同溫度對臭李子中單寧提取效果的影響；以丙酮溶液的濃度為60%，提取溫度50℃ ，超聲波功率40 W，選擇40, 60，80，100和120 min五個不同的提取時間研究對臭李子中單寧提取效果的影響；丙酮溶液的濃度為60%,處理溫度50℃，處理時間80 min，設(shè)置超聲波功率為20，30，40，50和60 W，比較不同超聲波功率對臭李子中單寧波提取效果的影響。

1.3響應(yīng)面試驗設(shè)計

  響應(yīng)面試驗設(shè)計為了使提取工藝更加科學(xué)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnkenfl11設(shè)計原則，選取提取溶劑濃度、提取溫度、超聲波功率和提取時間對單寧提取量較顯著的四個因素，以單寧提取量為響應(yīng)值，設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面試驗，響應(yīng)面試驗因素與水平表如表1所示。

2結(jié)果與分析

2.1  沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

  圖1為沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程：y=0.165 4x-0.084，其中R2=0.994 8。結(jié)果表明，測定值在0～5.0mg/L范圍內(nèi)線性良好。

2.2以丙酮溶液濃度為梯度進(jìn)行單因素試驗

  隨著丙酮濃度的升高，單寧提取量逐漸增大，但超過60%以后，增大趨勢不是很明顯，結(jié)果見圖2。提取溶劑濃度達(dá)一定程度時，有效成分基本完全析出，此時繼續(xù)增大料液比，更多雜質(zhì)溶出，而且增加了生產(chǎn)成本。因此可選取50%～70%的丙酮溶液作為提取液。

2.3  以提取溫度為梯度進(jìn)行單因素試驗

  隨溫度升高提取率迅速增高，50℃附近時達(dá)到最大，結(jié)果見圖3。這可能是在較高的溫度條件下，由于超聲波的機(jī)械效應(yīng)和形成的微射流而使得單寧分子運動速度加快，易于氧化所造成的。因此可選擇40℃~60℃為提取溫度。

2.4  以超聲波功率為梯度進(jìn)行單因素試驗

  在20～40 W范圍內(nèi)單寧的提取量隨超聲波功率的增大而提高，超過40 W后降低，結(jié)果見圖4。這可能是由于隨著超聲波功率增大，并且放出大量的熱，體系中單寧分解的速度增加，故選用超聲波功率為30～50 W。

2.5以超聲波處理時間為梯度進(jìn)行單因素試驗

  延長處理的時間會提高單寧提取量，但超過80min以后開始迅速降低，結(jié)果見圖5。這是由于單寧分子在長時間超聲波的作用下會迅速分解。因此可選用70～90 min作為超聲波處理時間。

2.6  Box- Behenken試驗結(jié)果及條件優(yōu)化

2.6.1超聲波輔助提取臭李子中單寧的響應(yīng)面試驗

  以臭李子中單寧提取量(Y)作為指標(biāo)，以提取溶劑濃度( X1)，提取溫度（X2），超聲波功率（X3），提取時間（X4）為試驗因素，響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計表和試驗結(jié)果見表2，試驗結(jié)果方差分析表3，模型系數(shù)及顯著性分析見表4。

  分析結(jié)果如表3所示�；貧w模型F值為32.03，p <0.000 1，表現(xiàn)為“極顯著”，因此可以使用該模型。失擬誤差平方和為109.611 860，表現(xiàn)為“不顯著”，表明該方程對試驗的擬合情況好。且相關(guān)系數(shù)R2=0.969 7，接近1，這表明模型與實際情況吻合程度較高，預(yù)測值和真實值之間有較好的相關(guān)性，因此可用此回歸方程對試驗結(jié)果進(jìn)行分析預(yù)測。從由F值可以得到各因素對單寧提取量影響從大到小的順序依次為：提取溫度（X2）>超聲波功率（X3）>提取時間（X4）>提取溶劑濃度(X1)。

  通過二次回歸分析對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，確立超聲波輔助提取臭李子中單寧的最優(yōu)擬合二次多項式方程，其回歸方程系數(shù)見表4中估值。由表4可知，以單寧提取量(Y)為因變量，以提取溶劑濃度（X1），提取溫度（X2），超聲波功率（X3）和提取時間（X4）的編碼值為自變量的三元二次回歸方程為：Y=-2 231.473 845+18.358 818X1+23.202 504X2+12.363 053X3+25.616 420X4-0.124 731X12+0.009 200X2X1-0.247 277X22+0.016 800 2X3X1-0.000 070 0X3X2-0.149 864X32-0.053 168X4X1+0.024 350X4X2-0.012 375X4X3-0.144 240X42。

圖6~圖1 1分別說明提取溶劑濃度，提取溫度，超聲波功率，提取時間兩兩之間的交互作用臭李子中單寧提取量的影響關(guān)系。從6個圖可以看出，臭李子中單寧提取量最初會跟隨這4個因素的逐漸增大而不斷爬升；但是超過這4個因素在試驗中選取的中心值時，臭李子中單寧提取量會隨著因素水平的上升而下降。   

 比較這6個圖，加之結(jié)合回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗試驗，可以清楚地得到這4個因素的交互作用對臭李子中單寧提取量的影響的顯著程度，從而得出提取溫度對臭李子中單寧提取量影響最大，曲面呈現(xiàn)比較陡，其次是超聲波功率和提取時間，影響作用最低的因素是提取溶劑濃度，曲面整體表現(xiàn)較為平滑。

2.6.2響應(yīng)曲面試驗的最佳優(yōu)化結(jié)果及試驗驗證

  通過使用軟件對試驗得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化得到的最佳工藝條件為：提取溶劑濃度為61.20%，提取溫度為51.94℃，超聲波功率41.25 W，提取時間為80.13min。臭李子中單寧提取量為214.21 mg/kg。

2.7精密度試驗

  分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1 m L，按照1.2.1.5中的方法重復(fù)5次，測定吸光度，求得RSD=3.28%，表明儀器精密度良好。結(jié)果見表5。

2.8重復(fù)性試驗

  按照2.6.2中所得的最佳超聲波輔助提取條件提取樣品中單寧，并按照1.2.1.5中的方法測定供試樣品吸光度并計算單寧的提取量，做5次平行，結(jié)果見表6。由表6可知，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差( RSD)為0.83%，表明方法重復(fù)性較好。

2.9  回收率試驗

  取已測得單寧含量的臭李子提取液0.25 m L，再加1 g/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0.75 m L，按照1.2.1.5中方法測定吸光度并計算單寧含量，做5次平行，計算回收率。結(jié)果見表7。由表7可知平均回收率為99.94%，RSD為0.7%。

3結(jié)論

試驗通過使用輔助的超聲波能量加速提取臭李子中單寧及通過使用Design—Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，得出最佳工藝條件：提取溶劑濃度為61.20%，提取溫度為51.94℃，超聲波功率為41.25 W，提取時間為80.13 min。在此條件下，臭李子皮單寧提取量為214.21 mg/kg。對該結(jié)果進(jìn)行3次驗證，與軟件優(yōu)化的結(jié)論吻合性較好，因而具有較高的可信性。使用該方法的回收率為99.94%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.7%。該試驗結(jié)果可以為在天然物質(zhì)的提取生產(chǎn)上提供一定的實際意義。

4摘要研究了以超聲波為輔助手段提取臭李子中單寧的試驗條件。在單因素的基礎(chǔ)上，用Box-Behnk。n組合試驗設(shè)計來優(yōu)化試驗條件。以四因素三水平的響應(yīng)面試驗優(yōu)化了單寧提取的最佳工藝條件。最佳條件如下：提取溶劑濃度為61.20%，提取溫度為51.94℃，超聲波功率41.25 W,提取時間為80.13 min,單寧提取量為214.21 mg/kg。采用鎢酸鈉一鉬酸鈉顯色分光光度法測定臭李子中單寧。該方法的回收率為99.94%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.7%。結(jié)論，該方法簡便準(zhǔn)確，靈敏度高，重復(fù)性好。