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作者：鄭曉敏

    激光是一種新型的光源，它具有高單色性、高定向性、極窄的頻率密度和極短的發(fā)光時(shí)間等特性。紫外波段激光能量高，但對(duì)人眼產(chǎn)生的危害大、價(jià)格昂貴，紅外和遠(yuǎn)紅外波段激光功率大，能耗高，價(jià)格昂貴，而可見光波段激光成本相對(duì)低廉，技術(shù)成熟，應(yīng)用廣泛。因此，本研究以常見的銅綠微囊藻（Microcvstisaeruginosa）作為實(shí)驗(yàn)藻種，在可見光范圍內(nèi)研究了激光對(duì)銅綠微囊藻的抑制效果，及激光對(duì)銅綠微囊藻光合系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)的影響，由此探究激光對(duì)銅綠微囊藻的抑制機(jī)理。

1實(shí)驗(yàn)材料與方法

11實(shí)驗(yàn)材料

  銅綠微囊藻FACHB -915取自中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫。采用BGIl培養(yǎng)基在三角瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度(24±0.5)℃，光強(qiáng)2 000 lx，光暗時(shí)間比為14 h:10 h，手搖3次ld，實(shí)驗(yàn)均采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的銅綠微囊藻（胞密度在6.5xl06_2.5xl07cells/mL之間）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

  細(xì)胞計(jì)數(shù)：采用血球計(jì)數(shù)板法。銅綠微囊藻細(xì)胞光密度（OD60）測(cè)定：Cary60分光光度計(jì)（AgilentTechnologies公司）。

  激光照射方法：取5 mL藻液于10 mL離心管（外壁包裹錫箔紙），激光器（銘輝科技公司，型號(hào)見表1）從管口豎直向下照射。

  初級(jí)生產(chǎn)力及抑藻率的測(cè)定：采用黑白瓶法測(cè)定凈初級(jí)生產(chǎn)力（以02計(jì)）。

  凈初級(jí)生產(chǎn)力[g(O2)／(m3·d)]_(DOt-DOo)/t;其中DOo為初始溶解氧，DOt為t時(shí)間后溶解氧，t為培養(yǎng)時(shí)間。

  抑藻率(%)=（空白組凈初級(jí)生產(chǎn)力一實(shí)驗(yàn)組凈初級(jí)生產(chǎn)力）／空白組凈初級(jí)生產(chǎn)力xl00%

  光合活性的測(cè)定：取3 mL待測(cè)藻樣，暗適應(yīng)5 min，用Water-PAM(德國walz公司)測(cè)定其葉綠素?zé)晒庀嚓P(guān)參數(shù)。

  SOD的提取和測(cè)定：將藻液在5 000 r/min下冷凍離心15 min，棄上清液，加入濃度0.01 mo1/L，pH為7.2的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，在冰水浴中用JY92-IIN細(xì)胞粉碎機(jī)（新芝生物科技公司，功率200 W，工作4s間隙5s）破碎50次，在11 000 r/min下冷凍離心15 min，取上清液用于蛋白含量和SOD的測(cè)定。蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)-G250染色法。SOD按照生物試劑盒（南京建成生物試劑盒）說明書測(cè)定。

  藻細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察：用PBS離心漂洗藻細(xì)胞2-3次，加入2.5%戊二醛固定，乙醇脫水，切片并染色，最后在透射電鏡下觀察并拍照。

  數(shù)據(jù)處理里：采用Origin80作圖，SPSSl9 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果和討論

2.1  不同波長(zhǎng)激光對(duì)銅綠微囊藻抑制效果的比較

  表2是功率50 mW的4種波長(zhǎng)激光照射銅綠微囊藻30 min后測(cè)定的凈初級(jí)生產(chǎn)力和抑藻率�？梢钥闯觯�650 nm的紅光激光的抑藻率高于其他3種波長(zhǎng)。因此，650 nm紅光激光的抑藻效果最好。

  不同波長(zhǎng)激光通過同一介質(zhì)有不同的透射率，在可見光( 400-800 nm)范圍內(nèi)，黃綠光激光對(duì)血紅蛋白透射率最低，而紅光激光對(duì)細(xì)胞組織具有最強(qiáng)的穿透力。此外，銅綠微囊藻在可見光范圍的吸收峰在430 nm和670 nm左右。說明紅光激光對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞的透射率最高，而且銅綠微囊藻對(duì)紅光激光具有很好的吸收效率，更容易對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生脅迫，所以在相同的時(shí)間內(nèi)紅光激光的抑藻效果最佳。

2.2  不同照射時(shí)間下激光對(duì)銅綠微囊藻的抑制作用

  表3為功率lW，波長(zhǎng)650 nm激光照射0、2、4、6、8和10 min后測(cè)定的凈初級(jí)生產(chǎn)力和抑藻率�？煽闯�，隨著激光照射時(shí)間增加，凈初級(jí)生產(chǎn)力減小，抑藻率增大，照射10 min后抑藻率達(dá)到93 .88%。說明激光照射時(shí)間越長(zhǎng)，抑藻效果越好；為驗(yàn)證激光抑藻效果的持久性，將激光照射5、10、15和20 min后的銅綠微囊藻接種并培養(yǎng)，圖1為銅綠微囊藻恢復(fù)生長(zhǎng)情況。與對(duì)照組相比，激光照射的藻樣恢復(fù)生長(zhǎng)受到不同程度的抑制，照射時(shí)間越長(zhǎng)，藻細(xì)胞增長(zhǎng)越慢。其中，激光照射5 min和10 min的銅綠微囊藻生長(zhǎng)受到明顯抑制，但仍然能夠增殖，可能是激光向下透射銅綠微囊藻時(shí)光強(qiáng)逐漸減弱，當(dāng)照射時(shí)間較短時(shí)，處于離心管底部的部分藻細(xì)胞并沒有完全被破壞。激光照射15 min和20 min后銅綠微囊藻受到激光足夠的能量脅迫，藻細(xì)胞徹底受到抑制，停止生長(zhǎng)和繁殖，說明其細(xì)胞受到不可恢復(fù)的破壞。

2.3激光對(duì)銅綠微囊藻光合活性的影響

  葉綠素?zé)晒鈪��?shù)可作為逆境條件下植物抗逆反應(yīng)的指標(biāo)之一，強(qiáng)光可引起藻類光合作用的光抑制。激光作為一種能量高度集中的單色光可能對(duì)微囊藻光合系統(tǒng)產(chǎn)生抑制。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，激光照射銅綠微囊藻10 min過程中，藻液溫度可由26.5℃升高至40℃。為探究激光產(chǎn)生的熱效應(yīng)對(duì)銅綠微囊藻光合活性的影響，測(cè)定了650 nm激光照射銅綠微囊藻0、2、4、6、8、10 min和40℃水浴加熱10 min后銅綠微囊藻PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量（FvlFm）（圖2）�？煽闯觯�隨著激光照射時(shí)間增加，銅綠微囊藻FvlFm呈減小趨勢(shì)，照射10 min后為0；而水浴加熱10 min后FvlF，n為0.325，略小于對(duì)照組(0.359)，說明熱效應(yīng)只能對(duì)銅綠微囊藻的光合活性產(chǎn)生十分輕微的影響，激光對(duì)銅綠微囊藻的抑制主要是由非熱效應(yīng)引起的。FvlFm的大小反映PSⅡ反應(yīng)中心內(nèi)稟光能轉(zhuǎn)換效率，F(xiàn)vlFm值越大表示PSⅡ反應(yīng)光能轉(zhuǎn)換效率越高。說明激光照射會(huì)影響銅綠微囊藻PSⅡ光能轉(zhuǎn)化效率，使光合作用得到抑制，當(dāng)達(dá)到一定照射時(shí)間時(shí)銅綠微囊藻光合作用被完全破壞。

2.4激光對(duì)銅綠微囊藻SOD活性的影響

  圖3為激光照射不同時(shí)間后銅綠微囊藻SOD活性的對(duì)比，可以看出，隨著激光照射時(shí)間增加，銅綠微囊藻SOD活性緩慢升高，照射15 min后達(dá)到最大值（18.25 U/mgprot）。SOD是生物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)清除活性氧(ROS)的第一道防線，其活性受到．02-的誘導(dǎo)而升高，歧化．02-并產(chǎn)生H202，可有效清除生物體內(nèi)的氧自由基，對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用。當(dāng)照射時(shí)間較短時(shí)，SOD隨照射時(shí)間增加而增大，說明激光照射使微囊藻細(xì)胞受到氧化損傷，通過增加'SOD來減弱細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基，從而減輕激光脅迫引起的活性氧傷害。在照射20 min后SOD完全突變?yōu)?，說明銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)SOD酶系統(tǒng)己經(jīng)被過量．02-破壞，失去了抵御活性氧傷害的能力，銅綠微囊藻可能完全死亡。

2.5激光對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

  如圖4所示為激光照射0、5、7、10 min后微囊藻樣品透射電鏡下觀察的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)變化。對(duì)照組圖4(a)微囊藻細(xì)胞形態(tài)健康，胞質(zhì)內(nèi)類囊體光合片層含量豐富，中央擬核區(qū)明顯。激光照射5 min(圖4(b))和7 min(圖4(c))后類囊體片層出現(xiàn)變形、斷裂和間隙，核區(qū)出現(xiàn)空洞，核質(zhì)往周圍彌散，有大量偽空泡。照射10 min后，類囊體消失殆盡，細(xì)胞質(zhì)固縮聚集，形成均質(zhì)樣顆粒，出現(xiàn)質(zhì)壁分離現(xiàn)象。銅綠微囊藻類囊體片層外表面上附有藻膽體，其生理功能是捕獲光的激發(fā)能，然后傳遞給光合作用片層中的葉綠素a，從而進(jìn)行光合作用。說明激光能破壞類囊體結(jié)構(gòu)，從而降低藻細(xì)胞色素的光能捕獲和傳遞能力，最終使微囊藻細(xì)胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)化和電子傳遞過程終止，細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝所需要的能量和有機(jī)物供應(yīng)不足致使細(xì)胞死亡。此外，微囊藻細(xì)胞核區(qū)遭到破壞，使內(nèi)部DNA等遺傳物質(zhì)受到損壞，細(xì)胞壁也遭受破壞，從而使細(xì)胞失去自我保護(hù)能力，加劇了藻細(xì)胞的死亡。

3結(jié)論

  激光對(duì)銅綠微囊藻具有抑制作用。不同波長(zhǎng)激光對(duì)銅綠微囊藻的抑制效果不同，650 nm紅光激光對(duì)銅綠微囊藻的抑制效果最好。功率為lW，波長(zhǎng)650 nm激光照射對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的銅綠微囊藻10 min，抑藻率可達(dá)93.88%以上；用此激光照射15 min可完全破壞銅綠微囊藻的恢復(fù)生長(zhǎng)能力。

  激光的高定向性和高度集中的能量使激光能破壞銅綠微囊藻的光合系統(tǒng)，導(dǎo)致銅綠微囊藻光能轉(zhuǎn)化效率降為0，從而徹底喪失光合活性；激光脅迫下，銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生氧化損傷，．02-升高，藻細(xì)胞通過增加SOD來減弱氧自由基，照射時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)藻細(xì)胞失去氧化損傷防御能力，SOD降為0；激光可使銅綠微囊藻細(xì)胞類囊體、中央核區(qū)、偽空泡和細(xì)胞壁等結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而使細(xì)胞失去物質(zhì)與能量轉(zhuǎn)化能力、信息傳遞功能和抵御外界干擾能力，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

激光抑藻具有快速、高效、無污染，操作簡(jiǎn)單，后期維護(hù)方便等優(yōu)點(diǎn)。但功率太大的激光器價(jià)格昂貴，技術(shù)還不夠成熟，需要進(jìn)一步研究和實(shí)踐，并結(jié)合其他控藻方法進(jìn)行優(yōu)化，在湖泊和水庫的藍(lán)藻水華治理中具有廣闊的應(yīng)用前景。 

4摘要：為探索激光抑藻的效果及其機(jī)理，研究了不同波長(zhǎng)激光對(duì)銅綠微囊藻的抑制效果，探討了激光對(duì)銅綠微囊藻光合活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性和細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，650 nm紅光激光的抑藻效果最好；功率lW波長(zhǎng)650 nm激光照射銅綠微囊藻lO min抑藻率達(dá)到93.88%；激光照射15 min的銅綠微囊藻生長(zhǎng)不可恢復(fù)；激光照射lO min可破壞銅綠微囊藻光合系統(tǒng)，使最大光化學(xué)量子產(chǎn)量（FvlFm）降至0；激光照射15 min后銅綠微囊藻SOD活性升到18.25 U/mgprot，高于對(duì)照組（5.87 U/mgprot，P<0.05）；激光照射可破壞銅綠微囊藻細(xì)胞類囊體、擬核和細(xì)胞壁等結(jié)構(gòu)。