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作者：張毅                

     目前，提取中藥多糖多采用水提醇沉淀法，這樣得到的粗多糖中蛋白質(zhì)含量較高，而據(jù)資料顯示，粗多糖脫蛋白后其生物活性更高。

  試驗以黃秋葵嫩果為原料，通過熱水浸提、乙醇沉淀的工藝獲得水溶性黃秋葵多糖，研究制備均一黃秋葵多糖的柱層析條件，并采用柱層析法對其中的多糖成分進(jìn)行分級純化。

1  材料與方法

1.1材料及試劑

  材料：黃秋葵。

  試劑：葡萄糖、苯酚、濃硫酸、正丁醇、氯仿、考馬斯亮藍(lán)G-250、胰蛋白酶(1: 250)、DEAE-纖維素、0.5%苯甲胺藍(lán)、濃氨水。

112儀器與設(shè)備

  UV757CRT型紫外可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；BS2-160自動部分收集器：上海青浦滬西儀器廠；HL-2D定時數(shù)據(jù)恒流泵：上海滬西分析儀器廠有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；等。

1.3方法

1.3.1黃秋葵多糖的提取

  將烘干的黃秋葵粉碎過篩，于100℃水浸提兩次，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，后加入3倍體積的95%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇沉淀，4℃以下低溫靜置過夜，離心（轉(zhuǎn)速4 000 r/min），沉淀加蒸餾水溶解，再次重復(fù)乙醇沉淀的步驟兩次，最后一次得到的沉淀用少量水溶解。

1.3.2多糖含量的測定

  多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=58.277x+0.014 1，相關(guān)系數(shù)：R2=0.995（x為葡萄糖的質(zhì)量濃度，單位為mg/m L；y為吸光度）。

1.3.3蛋白質(zhì)含量的測定

  得回歸方程為：y=0.727 0x+0.440 2，相關(guān)系數(shù)：R2=0.998 7（x為蛋白質(zhì)的濃度，單位為mg/m L;y為吸光度）。

1.3.4  DEAE-纖維素再生處理

  稱DEAE-纖維素20 g于200 m L去離子水泡12 h，抽濾后用200 m L 1mol/L NaOH浸泡20 min，再用去離子水洗至中性，然后用200 m L 1 mol/L HC1浸泡20

min，重復(fù)3次，再用純水平衡。

1.3.5篩選適合黃秋葵多糖吸附的pH

  取再生好的DEAE-纖維素各1g加入10 m L離心瓶中，加入不同pH的多糖溶液4 m L，振蕩吸附3h后，測溶液中多糖、蛋白質(zhì)濃度。

1.3.6分離純化

  層析柱介質(zhì)為DEAE-纖維素，將多糖的水溶液pH調(diào)為6上樣，用不同pH，不同NaOH以及不同NaCl濃度進(jìn)行洗脫。利用自動部分收集器分段進(jìn)行收集。測多糖和蛋白質(zhì)濃度并繪制出洗脫曲線，收集主要吸收峰中間部分。

1.3.7多糖純度檢驗

  用濾紙進(jìn)行層析，用體積比為60：40：5的正丁醇、濃氨水與水的混合液為擴展劑，展開7h，用0.5%甲苯胺藍(lán)乙醇溶液染色，95%乙醇漂洗至背景無色。

2結(jié)果與分析

2.1黃秋葵多糖提取液中的多糖和蛋白質(zhì)的含量

  通過考馬斯亮蘭法和硫酸-苯酚法分別測定黃秋葵多糖提取液的蛋白質(zhì)的含量和多糖的含量，得出黃秋葵多糖提取液中蛋白質(zhì)的含量為0.218 mg/m L，多糖的含量為13.48 mg/m L。

2.2適合黃秋葵多糖吸附的pH

  取再生好的DEAE-纖維素各1 g加入10 m L離心瓶中加入pH分別為5，6，7，8和9的多糖溶液4 m L，振蕩吸附3h后，測溶液中多糖、蛋白質(zhì)濃度，見圖1。多糖濃度低的而蛋白質(zhì)濃度高的說明吸附多糖效果好，由圖1得適合黃秋葵多糖吸附的pH為6.0。

2.3分離純化

  采用DEAE-纖維素柱進(jìn)行層析，上樣量為16m L，洗脫速度為0.16 m L/min，先后用純水，濃度分別為0.2，0.6和1.0 mol/L NaCl，濃度分別為0.1和1 mol/LNaOH洗脫，測量各管多糖濃度得洗脫曲線，見圖2。峰1是0.6 mol/L NaCl洗脫得到。峰2是1 mo/L NaCl洗脫得到。峰3，4是0.1 mol/L NaOH洗脫得到。

  采用DEAE-纖維素柱進(jìn)行層析，上樣量為25m L，洗脫速度為0.47 m L/min，先用純水洗柱，用不同pH的0.6 mol/L NaCl18.0, 9.0和11.0再用0.1和1 mol/LNaOH洗脫，測量各管多糖濃度得洗脫曲線，見圖3。峰5是pH為8的0.6 mol/L NaCl洗脫得到。峰6是1mol/L NaOH洗脫得到。

  采用DEAE-纖維素柱進(jìn)行層析，上樣量為25m L，洗脫速度為0.56 m L/min，先用純水洗柱，分別用不同濃度的NaOH 0.05，0.1，0.3，0.5和0.7 mol/L洗脫，測量各管多糖濃度得洗脫曲線，見圖4。峰7是純水洗脫得到。峰8是0.05 mol/L NaOH洗脫得到。

  采用DEAE-纖維素柱進(jìn)行層析，上樣量為25m L，洗脫速度為0.47 m L/min，先用純水洗柱，用0.6mol/L NaCl在pH分別為6和8時洗脫再分別用0.05和0.1mol/L的NaOH洗脫，測量各管多糖濃度得洗脫曲線，見圖5。峰9是pH為6的0.6 mol/L NaCl洗脫得到。峰10

是0.05 mol/L NaOH洗脫得到。

2.4多糖的純度檢驗

  以pH 6.0多糖溶液上樣，上樣量25 m L，先用純水洗脫，再分別用0.05，0.1，0.3，0.5和0.7 mol/L NaOH進(jìn)行分步洗脫，洗脫速度為0.47 m L/min，紙層析檢驗結(jié)果顯示0.05 mol/L NaOH洗脫的多糖為一斑點，說明此多糖較均一。

3結(jié)論

  在四組純化條件篩選中雖有多處出現(xiàn)單一對稱峰，但是經(jīng)紙層析檢驗后以pH 6.0多糖溶液上樣，上樣量25 m L，先用純水洗脫，再分別用0.05，0.1，0.3，0.5和0.7 mol/L NaOH進(jìn)行分步洗脫，洗脫速度為0.47 m L/min的洗脫條件下的層析效果較佳。摘要以黃秋葵嫩果為原料，通過熱水浸提法，乙醇沉淀的工藝獲得水溶性黃秋葵多糖，采用DEAE-纖維素離子交換柱純化多糖，探討不同pH，不同NaOH濃度和不同NaCl濃度對黃秋葵多糖的洗脫效果，初步確定合適的純化條件為：以pH 6.0多糖溶液上樣，上樣量25 m L，先用純水洗脫，再分別用0.05，0.1，0.3，0.5和0.7 mol/L NaOH進(jìn)行分步洗脫，洗脫速度為0.47 m L/min,紙層析檢驗0.05 mol/L NaOH洗脫得較均-多糖。

4摘要以黃秋葵嫩果為原料，通過熱水浸提法，乙醇沉淀的工藝獲得水溶性黃秋葵多糖，采用DEAE-纖維素離子交換柱純化多糖，探討不同pH，不同NaOH濃度和不同NaCl濃度對黃秋葵多糖的洗脫效果，初步確定合適的純化條件為：以pH 6.0多糖溶液上樣，上樣量25 m L，先用純水洗脫，再分別用0.05，0.1，0.3，0.5和0.7 mol/L NaOH進(jìn)行分步洗脫，洗脫速度為0.47 m L/min,紙層析檢驗0.05 mol/L NaOH洗脫得較均-多糖。