血紅裸藻多肽的提取及對小鼠運(yùn)動耐力影響研究
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馬文鋒1，安獻(xiàn)周2
1．江蘇大學(xué)體育部（鎮(zhèn)江212013）；2．洛陽師范學(xué)院體育學(xué)院（洛陽471022）
摘要試驗(yàn)以血紅裸藻為原料，研究血紅裸藻多肽的響應(yīng)面提取工藝及其對小鼠運(yùn)動耐力影響。研究結(jié)果表明：血紅裸藻多肽提取最佳工藝條件為超聲功率為254.2 W,超聲提取時間為22.7 min,胰蛋白酶用量為3.80A，pH為8.5。通過測定小鼠力竭運(yùn)動時間、運(yùn)動后血清一氧化氮(NO)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力，研究血紅裸藻多肽對小鼠運(yùn)動耐力影響。結(jié)果表明，相對于生理鹽水對照組，血紅裸藻多肽組的小鼠力竭運(yùn)動時間分別延長了6.97%，14.27%和35.78%，小鼠的血清No含量和SOD活力提高。血紅裸藻多肽能較好地提高小鼠運(yùn)動耐力。
關(guān)鍵詞血紅裸藻；多肽；提�。哼\(yùn)動耐力
血紅裸藻，是裸藻門的代表植物，是生長于湖泊及池塘的浮游藻類。血紅裸藻當(dāng)中含有比較高的營養(yǎng)價值，富含蛋白質(zhì)、維生素等對人體有益的營養(yǎng)成分。血紅裸藻多肽是血紅裸藻蛋白經(jīng)過酶水解，精制后獲得的肽類，具備抗疲勞以及耐缺氧等多種功能。目前，國內(nèi)學(xué)者在其他藻類多肽提取方面的研究比較多，在血紅裸藻多肽的提取方面研究得較少。因此，試驗(yàn)利用響應(yīng)面分析法對血紅裸藻多肽的超聲輔助提取條件進(jìn)行優(yōu)化，并對其對小鼠運(yùn)動耐力的影響進(jìn)行研究，以期為血紅裸藻的有效利用和多肽資源的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。
1 材料及方法
1.1材料與試劑
血紅裸藻：實(shí)驗(yàn)室提供；SPF級KM小鼠：廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號為SCXK(粵)2013-0002，8周齡，體重(40+-2g)，共80只，雌雄各半。
氫氧化鈉溶液、鹽酸溶液、碳酸鈉溶液、脫脂棉、活性炭等：實(shí)驗(yàn)室提供；胰蛋白酶、牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液：深圳朗特試劑有限公司；Folin試劑、G-75葡聚糖凝膠：廣州方大試劑有限公司；血清一氧化氮( NO)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒、乳酸( LD)檢測試劑盒：廣州威美邦試劑有限公司。
1.2試驗(yàn)儀器與設(shè)備
ZFM-3050A型數(shù)顯超聲清洗器：佛山光大儀器有限公司；BJ3-UV2100紫外分光光度計(jì)：深圳榮升儀器有限公司；ATL-224-I分析天平：廣州新皓儀器設(shè)備有限公司；TGL-16型高速離心機(jī)：東莞普輝電子科技有限公司；RE-5286A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：廣州新皓儀器設(shè)備有限公司；FD-1A-50真空冷凍干燥機(jī)：佛山光大儀器有限公司；GZX-9070 MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：東莞萬達(dá)儀器有限公司。
1.3試驗(yàn)方法
1.3.1血紅裸藻多肽提取及純化工藝流程
1)血紅裸藻多肽超聲輔助提取工藝流程：血紅裸藻除雜->洗凈->風(fēng)干->稱量->剪碎->加水浸提->脫脂棉過濾->調(diào)pH->胰蛋白酶酶解->超聲輔助提取->離心 ->上清液活性炭吸附->減壓濃縮->冷凍干燥->血紅裸藻多肽粗品。
2)血紅裸藻多肽純化工藝流程；血紅裸藻粗品->水解->截留分子量100 kDa透析袋透析->截留分子量50 kDa透析袋透析->截留分子量10 kDa透析袋透析->冷凍干燥斗溶解->G-75葡聚糖凝膠過濾->收集->真空濃縮->冷凍干燥->血紅裸藻多肽純品。
1.3.2血紅裸藻多肽含量的測定
1)采用Folin-酚法測定血紅裸藻多肽的提取率。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：各取牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液( 250μg/m L)0.2, 0.5，0.9，1.5, 2.0和2.5 m L于6只容量瓶中，定容，以蒸餾水為空白，于215 nm處測定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。經(jīng)統(tǒng)計(jì)回歸處理，得到線性方程為y=0.901 2x-0.032 7，R2=0.999 5，x-標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，y-吸光度。
血紅裸藻多肽提取率的測定：將上述經(jīng)過純化的得到的血紅裸藻多肽，稀釋，取1 m L_上述血紅裸藻多肽溶液到比色管中，加3 mL Na2CO3溶液，恒溫水浴3 min后，再加1.0 m L Folin試劑，搖勻，恒溫水浴25 mm，同標(biāo)準(zhǔn)曲線法測血紅裸藻多肽的含量。
2)血紅裸藻多肽提取率=(C×V×n)/m×100%。
式中：C-測得的濃度，mol/L; V-體積，L；n-稀釋倍數(shù)；m-所用血紅裸藻的質(zhì)量，g。
1.3.3血紅裸藻多肽超聲提取條件的優(yōu)化
通過單因素試驗(yàn)考察超聲功率、超聲提取時間、胰蛋白酶用量和pH對血紅裸藻多肽提取效果的影響，在選取各因素的最優(yōu)試驗(yàn)范圍，采用響應(yīng)面分析法對血紅裸藻多肽超聲提取條件進(jìn)行優(yōu)化。
1.3.4血紅裸藻多肽對小鼠運(yùn)動耐力影響的試驗(yàn)
1)動物分組與給藥方式：實(shí)驗(yàn)室溫度為15 0C。將小鼠適應(yīng)性培養(yǎng)2d，2d后在傾斜度為120的動物跑臺進(jìn)行適應(yīng)性跑步訓(xùn)練。最開始3d，速度為12 m/min，每天訓(xùn)練15 min。之后4 d，速度為15 m/min，每天訓(xùn)練15 min。休息1d。剔除未能學(xué)會跑步的小鼠40只，剩下40只小鼠進(jìn)入試驗(yàn)。將小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，抽簽分為生理鹽水對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。相應(yīng)地喂食血紅裸藻多肽10 d后，在傾斜度為120的動物跑臺進(jìn)行力竭運(yùn)動試驗(yàn)。當(dāng)小鼠跑步至力竭，驅(qū)趕無效時，即停止試驗(yàn)，記錄時間與進(jìn)行取血試驗(yàn)。
2)指標(biāo)測定：小鼠的力竭運(yùn)動時間；心臟取血，全血經(jīng)過離心，取上清液，測定血清一氧化氮( NO)含量和超氧化物歧化酶(SOD)含量。
2結(jié)果與分析
2.1 血紅裸藻多肽超聲提取條件的優(yōu)化
2.1.1超聲功率對血紅裸藻多肽提取效果的影響
設(shè)定超聲提取時間為20 min，胰蛋白酶用量為4%，pH為9.0，分別在超聲功率為160，200，240，280, 320和360 W六個梯度下，按方法1.3.1提取血紅裸藻多肽并且測其提取率。由圖1可以看出，超聲功率為240 W時，血紅裸藻多肽提取效果較好。
2.1.2超聲提取時間對血紅裸藻多肽提取效果的影響
設(shè)定超聲功率為240 W，胰蛋白酶用量為4%，pH為9.0，分別在超聲提取時間為10，15，20，25，30和35 min六個梯度下，按方法1.3.1提取血紅裸藻多肽并且測其提取率。由圖2可以看出，超聲提取時間為20 min時，血紅裸藻多肽提取效果較好。
2.1.3胰蛋白酶用量對血紅裸藻多肽提取效果的影響
設(shè)定超聲功率為240 W，超聲提取時間為20 min，pH為9.0，分別在胰蛋白酶用量為1%，2%，3%，4%．5%和6%六個梯度下，按方法1.3.1提取血紅裸藻多肽并且測其提取率。由圖3可以看出，胰蛋白酶用量為4%時，血紅裸藻多肽提取效果較好。
2.1.4 pH對血紅裸藻多肽提取效果的影響
設(shè)定超聲功率為240 W，超聲提取時間為20 min，胰蛋白酶用量為4%，分別在pH為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0和10.0六個梯度下，按方法1.3.1提取血紅裸藻多肽并且測其提取率。由圖4可以看出，pH為8.0時，血紅裸藻多肽提取效果較好。
2.1.5血紅裸藻多肽的優(yōu)化試驗(yàn)
結(jié)合單因素試驗(yàn)的結(jié)果，分別選取超聲功率為200，240和280 W，超聲提取時間為15，20和25 min，胰蛋白酶用量為3% .4%和5%，pH為7.0，8.0和9.0，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化血紅裸藻多肽提取最佳工藝參數(shù)。因素水平見表1，結(jié)果見表2。
對血紅裸藻多肽提取進(jìn)行分析，超聲功率、超聲提取時間、胰蛋白酶用量、pH都是顯著因素。關(guān)于血紅裸藻多肽的提取率二次回歸擬合方程：
提取率=0.41- 5.946E-003×A+ 0.012×B- 7589E-003×C+0.024×D+ 0.038×AB- 8.750E-003×AC+ 8.142E-003×AD+0.014×BC+ 2.804E-003×BD- 3.750E-003×C D- 0.018×A2-0.025×B2-0.029×C2-0.029×D2。其中，A-超聲功率，B-超聲提取時間，C-胰蛋白酶用量，D-pH。
由表3可以看出，模型的p<0.000 l，而失擬項(xiàng)的p值為0.540 0，說明了血紅裸藻多肽提取的模型與實(shí)際情況擬合程度比較好，可以預(yù)測血紅裸藻多肽提取的條件。
由方差分析結(jié)果可以看出，AB的交互作用、AC的交互作用、AD的交互作用、BC的交互作用、CD的交互作用都顯著，根據(jù)血紅裸藻多肽提取試驗(yàn)結(jié)果和回歸方程各項(xiàng)的方差分析，由響應(yīng)面分析法優(yōu)化出血紅裸藻多肽提取最佳工藝條件為超聲功率為254.2 W，超聲提取時間為22.7 min，胰蛋白酶用量為3.8%，pH為8.5。
2.2血紅裸藻多肽對小鼠運(yùn)動耐力影響試驗(yàn)
2.2.1血紅裸藻多肽對小鼠力竭運(yùn)動時間的影響
從表4可以看出，隨著血紅裸藻多肽濃度的增加，血紅裸藻多肽低劑量組、中劑量組和高劑量組的小鼠力竭運(yùn)動時間逐漸增加，小鼠力竭運(yùn)動時間分別延長了6.97%，14.27%和35.78%。而且，與對照組相比，血紅裸藻多肽高劑量組差異十分顯著。因此，血紅裸藻多肽可以延長力竭運(yùn)動時間，延緩運(yùn)動疲勞的發(fā)生，提高運(yùn)動耐力。
2.2.2血紅裸藻多肽對小鼠血清NO含量、SOD活力的影響
從表5可以看出，小鼠經(jīng)過運(yùn)動訓(xùn)練后，隨著血紅裸藻多肽濃度的增加，血紅裸藻多肽低劑量組、中劑量組和高劑量組的小鼠血清NO含量依次增加。與對照組相比，血紅裸藻多肽組的小鼠血清NO含量高于對照組，特別是，血紅裸藻多肽高劑量組的小鼠血清NO含量比對照組高55.11%。血紅裸藻多肽促進(jìn)小鼠的組織釋放NO，舒張了血管平滑肌，使得小鼠的組織血管舒張，血液流動加快，從而提高小鼠組織運(yùn)動耐力。
隨著血紅裸藻多肽濃度的增加，血紅裸藻多肽低劑量組、中劑量組和高劑量組的小鼠SOD活力逐漸增加。與對照組比較，小鼠SOD活力也明顯提高，當(dāng)血紅裸藻多肽含量達(dá)到3.00 g/kg，差異顯著，SOD活力提高了45.31%。血紅裸藻多肽增加SOD活力，加快了自由基的消除和抑制了自由基的生成，從而緩解了自由基對細(xì)胞膜的攻擊，使得小鼠組織運(yùn)動耐力提高。
3結(jié)論
血紅裸藻多肽提取最佳工藝條件為超聲功率為254.2 W，超聲提取時間為22.7 min，胰蛋白酶用量為3.8%，pH為8.5。
經(jīng)過運(yùn)動訓(xùn)練后，相對于生理鹽水對照組，血紅裸藻多肽組的小鼠力竭運(yùn)動時間分別延長了6.97%，14.27%和35.78%。而且，小鼠的血清NO含量增加和SOD活力提高。因此，血紅裸藻多肽能較好地提高小鼠運(yùn)動耐力。
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