帶魚蛋白亞鐵螯合物的制備及性質(zhì)研究
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黃賽博，林慧敏，鄧尚貴
浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（舟山316022）
摘要帶魚蛋白亞鐵螯合物的制備及性質(zhì)比較。以帶魚魚糜為原料，酶解后根據(jù)酶解液體積加入不同量的FeCl2溶液進(jìn)行螯合，制備出不同比例(1%，2%，3%和4%帶魚蛋白亞鐵整合物(Fe-HPH),測定螯合物的螯合率、溶解度、吸濕性和熱變性溫度等。2% Fe-HPH螯合率最高；1%，2%，3%和4%螯合物分別在pH為4，5，6和7時達(dá)到最大溶解度；在相對濕度為43%和81%的環(huán)境中，吸濕性均為4% Fe-HPH>3% Fe-HPH>2% Fe-HPH>1% Fe-HPH; 4種Fe-HPH熱
變性溫度分別為51.3℃，62.4℃，68C和73.5℃，即隨著Fe2+加入量的增多而升高；紫外全波段掃描和紅外光譜驗證了螯合前后結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。螯合時加入Fe2+量不同，得到的螯合物性質(zhì)也各有差異。
關(guān)鍵詞酶解；亞鐵螯合；制備；性質(zhì)研究
帶魚，又名刀魚、裙帶、牙帶等，在中國海域廣泛分布，年捕獲量豐富，是我國四大海產(chǎn)之一。微量元素是指在人體中所占比例小于0.01%的礦物質(zhì)，包括銅、鐵、錳、鋅等10種元素，在機體內(nèi)比重雖極小，但在維持人體健康方面作用巨大。微量元素螯合物研究始于上世紀(jì)60年代。70年代后期，最先由美國Albion實驗室以動植物蛋白和鐵元素為原料合成鐵蛋白( Iron proteinase)的復(fù)合物，隨后其生物活性也逐漸被發(fā)現(xiàn)。李庭以米渣為原料，酶解后與硫酸鋅螯合，制備出米蛋白肽鋅，它對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌均有一定抑菌作用；Fisher把與EDTA連接的酪氨酸和苯丙氨酸與二價銅離子螯合，發(fā)現(xiàn)其抗氧化作用達(dá)到SOD（超氧化物歧化酶）的一半；李永富等用小肽螯合鐵作為補鐵劑，加入飼料喂養(yǎng)乳豬，結(jié)果顯示小肽鐵比硫酸亞鐵有更好的補鐵效果；Found(1974)報道，復(fù)合氨基酸、多肽鐵絡(luò)合物是以載體形式使位于環(huán)狀結(jié)構(gòu)中心的鐵離子得以順利通過腸黏膜刷狀緣，從而促進(jìn)鐵的吸收；韓希福等用蛋氨酸螯合鐵、鋅、錳喂豬和雞時，糖類和蛋白質(zhì)吸收利用率分別提高20%和15%。以帶魚魚糜為原料，以亞鐵為微量元素，根據(jù)Fe2+加入量的不同，研究不同比例帶魚蛋白亞鐵螯合物Fe-HPH的性質(zhì)差異，為微量元素螯合物作為功能食品的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1材料與試劑
帶魚魚糜，由浙江興業(yè)有限公司提供。用鋸子將冷凍魚糜分裝成100～200 g／袋，置于-20℃冰箱中保存。酶解前一晚移至4 ℃冷藏室中緩慢解凍。木瓜蛋白酶（Papain，酶活力20 000 IU/g），購自上海金穗生物科技有限公司；氯化亞鐵（食品級）、抗壞血酸、鹽酸羥胺、鄰二氮菲、氫氧化鈉等分析純試劑，均購自國藥集團藥業(yè)股份有限公司。
1.2儀器與設(shè)備
PHS-3C pH計，上海蘭科儀器有限公司；HWS-12電熱恒溫水浴鍋，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；SHAB恒溫水浴振蕩器，常州國華有限公司；FD-1000冷凍干燥機，日；N-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日EYELA；電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；DSC 200 F3差式量熱掃描儀，NETZSCH；LHS-250HC恒溫恒濕箱，上�；厶﹥x器制造有限公司；8400全自動凱式定氮儀，F(xiàn)OSS; U-2800紫外可見分光光度計，日日立；傅立葉紅外光譜儀，美國Nicolet。
1.3試驗方法
1.3.1 酶解及不同比例亞鐵多肽螯合工藝
取一定量過夜緩慢解凍好的魚糜，料液比按照1：10( g/m L)，溶于去離子水中，用攪拌機打成勻漿。用1 mol/L HC1溶液和1 mol/L NaOH溶液將混合漿液pH調(diào)至6.5，45℃下保溫10 min。根據(jù)魚糜質(zhì)量，按20 000 IU/g比例加入木瓜蛋白酶，攪拌均勻，在45℃下持續(xù)酶解8h。酶解完成后酶解液90℃，15min進(jìn)行鈍化滅酶，冷卻至室溫，利用抽濾和微濾去掉剩余殘渣，得到淡黃色澄清酶解液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器40℃真空濃縮，冷凍干燥后即得酶解多肽，備用。
將上述酶解液用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至7.0，按體積的0.1%加入抗壞血酸，溶解后，再按酶解液體積的1%，2%，3%和4%分別加入1 mol/L FeCl2溶液，30℃震蕩合成30 min，于4℃下10 000 r/min離心濃縮20 min，棄沉淀，上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器40℃真空濃縮，冷凍干燥后即得到不同螯合比例的多肽亞鐵螯合物（1%，2%，3%和4% Fe-HPH），備用。
1.3.2螯合率的測定
標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確稱取0.497 g硫酸亞鐵(FeSO4．7H2O)溶于100 m L水中，加入5 m L濃硫酸，微熱，溶解后即滴加2%高錳酸鉀溶液，至最后一滴紅色不褪色為止。用水定容至100 m L，搖勻，得標(biāo)準(zhǔn)貯備液。此液每毫升含F(xiàn)e3+100μg。取鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液10 m L于100 m L容量瓶中，加水至刻度，混勻，得標(biāo)準(zhǔn)工作液。此液每毫升含F(xiàn)e3+ 10 μg。精確吸取上述鐵標(biāo)準(zhǔn)液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0mL，分別置于50 m L容量瓶中，加入1 mol/L鹽酸溶液1mL、10%鹽酸羥銨1 m L、0.12%鄰二氮菲（現(xiàn)配現(xiàn)用）1mL，然后加入10%乙酸鈉溶液5 m L，用水稀釋至刻度，搖勻。以不加鐵的試劑空白液作參比液，在510 nm波長處，用1 cm比色皿測光密度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
螯合鐵源溶液濃度的確定：取1 m L Fe2+的鐵源溶液稀釋定容到100 m L，取1 m L按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制操作，定容至50 m L，測定其光密度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到相應(yīng)的鐵濃度C1(μg/m L)。通過換算，可求得加入鐵源溶液中總的亞鐵含量m1(g)。即：
式中：V1——表示加入的總鐵源溶液的體積( m L)。
游離亞鐵離子含量測定：將螯合液定容到100 m L，精確吸取5 m L螯合液定容到100 m L，取1 m L按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制操作，定容至50 m L，測定其光密度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的鐵濃度C2（μg/m L）。通過計算可求得游離亞鐵離子含量為m2 (g)。即：
式中：m1——鐵源溶液中總的亞鐵含量(g)；m2——游離亞鐵離子含量(g)。
1.3.3溶解性測定(pH)
通常用氮溶解指數(shù)(NSI)來評價。在室溫下，分別取0.2 g螯合物粉末，溶于5 m L不同pH (3，4，5，6，7，8和9)的水溶液中，攪拌至充分溶解。溶液pH用1 mo/L HC1和NaOH預(yù)先調(diào)節(jié)好。在12 000 r/min、4℃條件下離心15 min。取上清液1 m L，稀釋5倍，用雙縮脲方法測上清液的蛋白含量，凱式定氮法測定樣品總氮。
氮溶解指數(shù)(NSI)=上清液含氮量／樣品總氮×100% (4）
1.3.4吸濕性測定
將冷凍干燥的多肽粉和螯合物粉末準(zhǔn)確稱取1 g于培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中吸濕，控制相對濕度( RH)分別為81%和43% ，溫度20℃。分別稱量吸濕2，4，6，8，10，12和24 h后各試樣的質(zhì)量。吸濕率的計算公式：
式中：W n——吸濕后樣品質(zhì)量(g)；W0——吸濕前樣品質(zhì)量(g)。
1.3.5差示掃描量熱儀(DSC)測定
精確稱取試樣5×10 mg分別置于銀質(zhì)坩堝內(nèi)，蓋上鍋蓋，用密封壓機密封。依次用鑷子取下爐蓋和兩個內(nèi)蓋，用鑷子將盛放樣品的坩堝放在右側(cè)熱流傳感器的中心位置，空白坩堝放在左側(cè)熱流傳感器的中心位置，再依次蓋上兩個蓋子。設(shè)置升溫速率為100C/min，終止溫度為120 0C，液氮為冷卻介質(zhì)。
1.3.6紫外全波段掃描
稱取相同質(zhì)量的酶解肽粉和1%，2%，3%和4%Fe-HPH干粉，用適量去離子水溶解后進(jìn)行紫外全波段掃描，掃描間距為0.1 nm，觀察吸收峰。
1.3.7多肽亞鐵螯合物紅外光譜檢測
分別取1%，2%和3%酶解肽粉2 mg和4% Fe-HPH干粉2 mg，放入瑪瑙研缽中，放入干燥的光譜純KBr 200 mg，混合研磨均勻（在紅外燈下進(jìn)行），使其粒度在2.5 μm以下，裝入壓片模具，抽氣加壓，壓力約為60 M Pa，維持3～5 min，卸掉壓力則可得一透明KBr樣品片，利用紅外分光光度計進(jìn)行定性分析，得到光譜。
2結(jié)果與討論
2.1螯合率的確定
螯合率是指微量元素與氨基酸的螯合程度。螯合率的測定在衡量產(chǎn)品質(zhì)量、改進(jìn)生產(chǎn)工藝、研究微量元素的作用機理等方面均有積極意義。根據(jù)酶解液體積，按照不同比例加入FeCl2溶液得到的4種螯合物螯合率各不相同。如圖1所示，其中V代表FeCl2溶液的體積，V2代表酶解液的體積。螯合率高低依次為2% Fe-HPH>3% Fe-HPH>4% Fe-HPH>1% Fe-HPH，說明螯合率跟加入的Fe2+量不成比例，當(dāng)加入2% FeCl2溶液時，F(xiàn)e2+和氨基酸的螯合可能已達(dá)到
飽和。
2.2 Fe-HPH的溶解性
以帶魚蛋白酶解得到的多肽粉和螯合比例為1%, 2%，3%和4% Fe-HPH粉末為樣品，其溶解性隨pH的變化如表1所示。
由表1可知，pH分別為3，4和5時，4種Fe-HPH與酶解肽比溶解性差異均為極顯著(p<0.01)；pH 6時，除了4% Fe-HPH與酶解肽差異極顯著(p<0.01)外，其余三種無顯著性差異(p<0.05)；pH 7時，與酶解肽相比，1%和3% Fe-HPH差異極顯著(p<0.01)，2%Fe-HPH差異較明顯(p<0.05)，而4%Fe-HPH無顯著性差異(p<0.05)；pH 8時，1% Fe-HPH差異極顯著(p<0.01)，2%Fe-HPH無明顯差別(p<0.05)，而3%和4% Fe-HPH差異比較明顯( p<0.05)；pH 9時，4種螯合物與酶解肽比均無顯著性差異(p<0.05)。
酶解肽在pH 3時有最大的溶解度71.21%，此后溶解度變小，平均在60%左右，在pH 6時，可能因為接近魚蛋白自身酸堿值，溶解度形成一個小高峰64.52%。1%，2%，3%和4%螯合物分別在pH為4，5，6和7時有最大溶解度。在堿性pH條件下，溶解度均偏小，每組pH為9時溶解度最低。即加入Fe2+越多，F(xiàn)e-HPH最大溶解度的pH越大。金屬與多肽的結(jié)合，導(dǎo)致自身空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，由于金屬結(jié)合量的不同，溶解性也就有所差異。
2.3 Fe-HPH的吸濕性
酶解多肽及1%，2%，3%和4% Fe-HPH冷凍干燥后按前述方法測定其吸濕性。結(jié)果見圖2和3。
結(jié)果顯示，在RH為43%和81%的條件下，5組樣品的吸濕性均隨時間的延長而增強，但增長速度隨時間遞減，12 h后趨于穩(wěn)定。24 h后，5組在RH 81%時的吸濕性均比RH 43%時高。在0～2 h內(nèi)，RH 81%的各組吸濕率明顯高于RH 43%，但在2～12 h內(nèi)，RH 81%的吸濕率要低于RH 43%。
在RH為43%時，24 h 5組樣品的吸濕性大小分別為：(5)>(4)>(3)>(2)>(1)，在RH為81%時，24 h 5組樣品的吸濕性大小同樣為：(5)>(4)>(3)>(2)>(1)，可見RH為43%或81%，4%的Fe-HPH的吸濕性均最高。
2．4 Fe-HPH的熱變性溫度
差式掃描量熱法是在溫度程序控制下，測量輸送給被測物質(zhì)和參比物質(zhì)的能量差值與溫度之間的關(guān)系的一組技術(shù)，大多數(shù)物質(zhì)隨著溫度的變化，結(jié)構(gòu)將發(fā)生變化，同時伴隨能量的改變。熱變性曲線的最大遷移點（吸熱峰）即樣品的熱變性溫度。酶解肽和17~4% Fe-HPH的熱遷移曲線如圖4所示。圖4中的曲線由下到上依次為酶解肽（未螯合），1%，2%，3%和4% Fe-HPH。
由圖可知，其變性溫度分別為47.5℃，51.3℃，62.4℃，68℃和73.5℃，表明Fe2+的加入會改變原呔的熱變性溫度，且加入的Fe2+越多，其變性溫度越高二可能由于肽與Fe2+結(jié)合后，生成絡(luò)合物，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而改變了熱變性溫度。
2.5 Fe-HPH紫外全波段掃描分析
紫外掃描結(jié)果如圖5所示，其中a為多肽掃描圖，b、c、d、e分別為1%，2%，3%和4% Fe-HPH掃描圖。由圖可知，多肽和螯合物的紫外掃描吸收峰數(shù)目相同，都是2個峰，但吸收波長和峰值存在明顯差異。a圖中，兩個峰的吸收波長為202和279 nm，前者的峰值顯著高于后者；b圖中，兩個峰的波長為204和255 nm；c圖中，兩個峰波長是203和263 nm；d圖為208和257 nm；e圖為205和250 nm，b、c、d和e中兩峰的峰值都是后者高于前者，恰與a相反。而200～220nm是因肽鍵存在引起的吸收峰，250～280 nm是部分氨基酸殘基引起的吸收峰，說明多肽與亞鐵螯合后，吸收峰發(fā)生推移，氨基酸殘基的特征吸收峰值減弱，肽鍵特征吸收峰峰值加強，可以推測Fe2+可能與氨基酸結(jié)合生成類似于肽鍵的結(jié)構(gòu)。
2.6 Fe-HPH的紅外圖譜分析
圖5是用溴化鉀壓片法測定帶魚酶解肽及Fe-HPH在波數(shù)400～4 000 cm-l范圍的紅外光譜圖，自上而下分別為酶解肽、1%、2%、3%和4% Fe-HPH。由圖可知，整個波數(shù)范圍內(nèi)主要出現(xiàn)4個波峰。屬于多肽紅外光譜的酰胺A譜帶位于3 415.27 cm-l處，主要由NH的伸縮振動所致；1 647.65 cm-1處的吸收峰屬于酰胺I帶，由C=O伸縮振動引起；1 407.35 cm-1屬于多肽氨基酸殘基的側(cè)鏈基團；1 046.17 cm-1屬于銨鹽NH4+的特征吸收峰。對比帶魚多肽紅外光譜圖發(fā)現(xiàn)加入了Fe2+后，氨基的伸縮吸收峰由3 415.27 cm-1分別往高波段移到3 420.48,3 423.03，3 423.16和3 426.72 cm-1處，吸收峰比多肽更強；酰胺I帶則向低波段方向發(fā)生移動，變成1646.02，11643.44，1 641.35和1 640.32 cm-1；銨鹽NH4+的特征吸收峰向高波段移了四五個波數(shù)，且峰值加強。酰胺A向高波數(shù)方向移動，酰胺I帶向低波數(shù)方向移動，銨鹽NH4+的特征吸收峰加強，充分說明多肽的氨基和羧基可能都參與了與Fe2+的配位，而不同比例Fe-HPH的吸收峰基本一致，說明Fe2+加入量的高低不會影響Fe-HPH的結(jié)構(gòu)。
3結(jié)論
利用帶魚魚糜和FeCl2溶液制備出4種不同比例的Fe-HPH，其性質(zhì)存在差異。2% Fe-HPH螯合率最高，說明螯合率的高低與Fe2+的加入量不成正比；多肽在pH 3時溶解性最好，1%，2%，3%和4% Fe-HPH分別在pH 4，5，6和7時達(dá)到最大溶解度，推斷隨著Fe2+螯合量增多，最大溶解度所處的pH將越大；在RH 43%和81%的條件下，24 h吸濕后吸濕性的高低均是4% Fe-HPH>3% Fe-HPH>2% Fe-HPH>1% Fe-HPH>多肽；多肽的熱變性溫度屬于正常蛋白質(zhì)變性溫度范圍內(nèi)，而4種Fe-HPH的熱性變溫度均高于多肽，推測加入Fe2+越多，鐵含量越高，變性溫度將越高。螯合飽和后剩余的Fe2+可能以FeCl2的形式繼續(xù)存在，因此也影響著螯合物的鐵含量；紫外全波段掃描中，多肽螯合亞鐵前后，氨基酸殘基吸收峰由強變?nèi)�，肽鍵吸收峰由若變強，推測Fe2+可能與氨基酸結(jié)合生成類似于肽鍵的結(jié)構(gòu)；紅外光譜中，推測F e2+與氨基、羧基發(fā)生結(jié)合。今后可以對Fe-HPH進(jìn)一步分離純化，研究其更多的生物活性，并對多肽和亞鐵螯合機理做進(jìn)一步研究。
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