不同堿處理蛋清與蛋黃堿誘導(dǎo)凝膠低場NMR T2弛豫時間分析
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范萌萌1．蔣愛民1*，張獻偉1,2，麥盛昕1，黃小峰1，陳賢1
1．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院（廣州510642）：2．惠州市海洋與漁業(yè)局(惠州516001)
摘要研究了不同堿處理對蛋清蛋黃堿誘導(dǎo)凝膠水分的影響，采用低場核磁共振技術(shù)測定凝膠中水分變化。結(jié)
果表明，0．60%和0．7%NaOH處理組蛋清凝膠的T弛豫時間圖上僅有2個峰，說明在凝膠體系中，存在2種水相狀態(tài)：結(jié)合水和不易流動水。0.7% NaOH處理組蛋清凝膠不易流動水T22為83.75±1.22 ms,顯著高于0.6% NaOH處理組蛋清凝膠不易流動水T2276.65±1.25 ms (p<0．05)；1.0%和1.2%NaOH處理組蛋黃凝膠的T2弛豫時間圖上有3個峰，說明在凝膠體系中存在3種水相狀態(tài)：結(jié)合水、不易流動水和自由水。T21從0.46±0.02 ms增加到0.69±0.03rris; T22從29.62±0．86 ms增加到36.80±0．53 ms; T23從198.45±4.94 ms增加到370.19±10.29 ms。說明T2可以反映蛋清和蛋黃堿誘導(dǎo)凝膠的水分狀態(tài)和組成。
關(guān)鍵詞低場核磁共振：橫向弛豫時間；水分測定；蛋清蛋黃堿誘導(dǎo)凝膠
皮蛋是一種主要由堿腌制而成的蛋制品，加工歷史悠久，是我國獨創(chuàng)的傳統(tǒng)蛋制品。近十幾年來，國內(nèi)學(xué)者對皮蛋加工工藝、無鉛化技術(shù)進行了大量的研究，毫無疑問，這些努力對促進皮蛋的科學(xué)生產(chǎn)起到了重要作用。皮蛋中的水分含量和狀態(tài)變化對皮蛋的品質(zhì)有著重要影響，通過烘干法測定的水分含量為蛋白凝膠中自由水與不易流動水的總含量。目前，低場核磁共振技術(shù)大多用在肉及肉制品的保水性和水分含量等方面，在地溝油的鑒定和方便米飯品質(zhì)的鑒定等食品檢測上也廣泛應(yīng)用，但是在蛋及蛋制品上的應(yīng)用較少。
報道H質(zhì)子共振頻率小于100 MHz的NMR，稱為低場核磁共振(Low field-NMR)。LF-
NMR作為一種快速無損的檢測技術(shù)，可以觀察水分中H質(zhì)子的流動和分布，得到樣品中水的動態(tài)變化情況。目前，LF-NMR用于食品中水分研究主要采用自旋一自旋弛豫（橫向弛豫）時間T2，是由于T2對水分多相態(tài)的存在更加敏感，通過分析T2弛豫時間的不同，較容易區(qū)分出不與固體顆�；蛉苜|(zhì)分子相互作用的易流動損失的自由水分和通過物理、化學(xué)作用緊密
結(jié)合的水分或不易移動水分。T2反映了樣品內(nèi)部氫質(zhì)子所處的化學(xué)環(huán)境，與氫質(zhì)子所受的束縛力及其自由度有關(guān)，而氫質(zhì)子的束縛程度又與樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)有密不可分的關(guān)系。氫質(zhì)子受束縛越大或自由度越小，T2弛豫時間越短，在T2譜上峰位置較靠左；反之則T2弛豫時間越長，在T2譜上峰位置較靠右。試驗通過LF-NMR測定弛豫時間T2，觀察在不同堿處理下蛋清與蛋黃堿誘導(dǎo)凝膠的水分分布狀態(tài)變化。
1 材料與方法
1.1原料
鴨蛋：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)三角市；食用級NaOH:濱化集團股份有限公司；茶多酚：浙江大學(xué)茶學(xué)系。
1.2主要儀器與設(shè)備
NMR PQO01分析儀：上海紐邁電子科技有限公司；HM-945多功能攪拌器：廣州東菱有限公司。
1.3試驗方法
蛋清和蛋黃堿誘導(dǎo)凝膠的制備：取新鮮鴨蛋數(shù)枚，用75%乙醇擦拭鴨蛋表面，保證其清潔、完整無損。破殼后去除系帶，分離蛋清與蛋黃，使用多功能攪拌器(1 000 r/min)分別攪拌1 min，靜置2 h，冷藏備用。將洗凈后的100 m L燒杯，置于121 0C高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，殺菌20～30 min。先將經(jīng)前處理的新鮮鴨蛋清和蛋黃倒入已滅菌的容器中，添加配好的腌制液，攪拌均勻后用保鮮膜密封，放到數(shù)顯恒溫恒濕箱中25 0C下蛋清堿誘導(dǎo)凝膠熟成24 h，蛋黃堿誘導(dǎo)凝膠熟成7 d。測試馳豫時間T2，研究不同堿處理對蛋清與蛋黃堿誘導(dǎo)凝膠加工過程中水分的變化。
參照Goetz等的方法并略有修改，測試條件為：質(zhì)子共振頻率為21.6 MHZ，測量溫
度為室溫( 30.00℃±0.01℃ )。將樣品切成1.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的長方體，放入離心管中再放人直徑15 mm的核磁管，進行測試。自旋-自旋弛豫時間T2用CPMG( Carr-Purcell-Mebiboom-Gill)序列進行測量。設(shè)置參數(shù)為：T-值（900脈沖和1800脈沖之間的時間）為300μs，重復(fù)掃描32次，重復(fù)間隔時間為6 500 ms得到16 000個回波，得到的圖為指數(shù)衰減圖形，每個測試有四個重復(fù)。NMR弛豫測量得到的圖為指數(shù)衰減曲線，其數(shù)學(xué)模型為：
式中：A(t)-------衰減到時間t時的幅值大��；t--------衰減時間；A0一平衡時的幅值大�。�
一第i個組分平衡時的幅值大�。籘2i一第i組分的自旋一自旋弛豫時間。
用儀器配套的Multi Ex PInv Analysis軟件進行反演CMPG指數(shù)衰減曲線，得到樣品的T2值。該軟件使用整體迭代修正的NMR弛豫信號多指數(shù)反演算法。
2結(jié)果與討論
2.1不同濃度堿處理對蛋清堿誘導(dǎo)凝膠T2的影響
圖1顯示不同堿處理對蛋清堿誘導(dǎo)凝膠T2弛豫時間的影響。由于0.6%和0.7%NaOH處理組蛋清凝膠表現(xiàn)出較強的凝膠特性，利用LF-NMR檢測了凝膠樣品的T2弛豫時間的分布，同時以新鮮蛋清的T2弛豫時間分布為空白對照。結(jié)果表明，不同堿處理對蛋清凝膠T2弛豫時間分布具有顯著的影響(p<0.05)。由圖1可知，對CPMG脈沖序列得到的衰減曲線進行多指數(shù)擬合后，發(fā)現(xiàn)T2在0.1～10 000 ms的弛豫時間分布上出現(xiàn)了3種峰，這與用LF-NMR測量乳清蛋白與卵白蛋白中得到的結(jié)果相類似。從圖1分析得出，這3種峰對應(yīng)時間為T21: 1.84—15.15 ms;T22：45.36 m—114.19ms；T23: 256.17—483.29 ms，可能分別對應(yīng)于樣品中水分的三種狀態(tài)結(jié)合水T21( Immobile phase)、不易移動水T22( Mobile phase)和自由水T23( Very mobilephase)。
新鮮蛋清的NMRT2弛豫時間圖上有2個峰，表明體系中存在2種水相狀態(tài)（結(jié)合水和自由水），其中結(jié)合水T21存在2個弛豫時間，分別為6.61±0.10 ms和8.63±0.14 ms，所占峰面積比例為6.83%±0.25%；自由水T23弛豫時間為364.81±5.30 ms，所占峰面積比例為93.17%±0.25%．表明新鮮蛋清中結(jié)合水比例很小，自由水比例占絕大多數(shù)，而不易流動水所占比例極小，未檢測出來。0.6%和0.7% NaOH處理組蛋清凝膠的T2弛豫時間圖上僅有2個峰，說明在凝膠體系中，存在2種水相狀態(tài)：結(jié)合水和不易流動水，其中不易移動水占絕大部分，未檢測出自由水，這可能由于蛋清在強堿NaOH的作用下，蛋白質(zhì)分子發(fā)生變性，經(jīng)分子間和分子內(nèi)相互作用交聯(lián)凝聚，反應(yīng)過程中再與體系中的水通過物理化學(xué)鍵合而形成凝膠三維空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而且體系中的自由水吸附填充在凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，“態(tài)變”水為不易流動水，結(jié)果表明堿處理可顯著改變蛋清體系中水相的分布，誘導(dǎo)蛋清蛋白質(zhì)發(fā)生變性并通過水合作用形成凝膠。0.7% NaOH處理組蛋清凝膠結(jié)合水T21弛豫時間為4.30±0.26 ms，顯著低于0.6% NaOH處理組蛋清凝膠結(jié)合水T21弛豫時間6.46±0.26 ms( p< 0.05)，表明不同堿處理可顯著影響凝膠體系中蛋白質(zhì)分子與水的鍵合力，其中蛋清經(jīng)0.7% NaOH處理后，變性的蛋白質(zhì)分子與體系中的水化學(xué)鍵合力強，水中的氫質(zhì)子受束縛較大，從而增強蛋清凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出較強的凝膠特性。此外，0.7% NaOH處理組蛋清凝膠不易流動水T22為83.75±1.22 ms，顯著高于0.6% NaOH處理組蛋清凝膠不易流動水T，76.65±1.25 ms和所占峰面積比例97.53%±0.20%( p< 0.05)。蛋清凝膠的T22弛豫時間和所占峰面積比例隨著NaOH含量增加而顯著升高，說明體系中較多的水分填充在凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，且這部分水的流動性增大，使蛋清凝膠具有較高的彈性和回復(fù)性，表現(xiàn)出較好的凝膠特性。
2.2不同堿處理對蛋黃堿誘導(dǎo)凝膠低場NMRT弛豫時間的影響
圖2顯示不同堿處理對蛋黃堿誘導(dǎo)凝膠T2弛豫時間的影響。結(jié)果表明，不同堿處理對蛋黃凝膠T2分布具有顯著的影響(P<0.05)。由圖2可知，對CPMG脈沖序列得到的衰減曲線進行多指數(shù)擬合后，發(fā)現(xiàn)T2在0.1—10 000 ms的弛豫時間分布上出現(xiàn)了3種峰，這與用LF-NMR測量蛋清堿誘導(dǎo)凝膠得到的結(jié)果相類似（圖1）。從圖2分析得出，這3種峰對應(yīng)時間為T21: 0～2.32 ms；T22: 8.76～60.53 ms; T23:62.30～203.36 ms．可能分別對應(yīng)于樣品中水分的三種狀態(tài)結(jié)合水T21( Immobile phase)、不易移動水T22( Mobile phase)和自由水T23(Very mobile phase)。
新鮮蛋黃的NMRT弛豫時間圖上有3個峰，表明體系中存在3種水相狀態(tài)（結(jié)合水、不易移動水和自由水），其中結(jié)合水T21弛豫時間為0.99±0.02 ms，所占峰面積比例為6.40%±0.22%；不易移動水T22弛豫時間為20.37±0.30 ms，所占峰面積比例為80.11%±0.26%；自由水T23弛豫時間為118.40±1.72 ms，所占峰面積比例為13.42%±0.30%，表明新鮮蛋黃中結(jié)合水比例最小，自由水比例次之，不易流動水比例占絕大多數(shù)，這可能是因為蛋黃中蛋白質(zhì)具有很好的乳化作用，能把脂肪分散成很小的油滴，水分包裹這層小油滴被蛋白質(zhì)所束縛，弛豫時間減小，水分流動性減弱。1.0%和1.2% NaOH處理組蛋黃凝膠的T弛豫時間圖
上有3個峰，說明在凝膠體系中存在3種水相狀態(tài)：結(jié)合水、不易流動水和自由水。隨著NaOH含量的增加，第一個峰值T21變化不大(P>0.05)，T22和T23都顯著增加(p<0.05)。T21從0.46±0.02 ms增加到0.69±0.03 ms，所占峰面積比例從1.51%±0.09%增加到2.61%±0.20%；T22從29.62±0.86 ms增加到36.80±0.53 ms，所占峰面積比例從96.14%±0.15%減少到95.90%±0.20%; T23從198.45±4.94 ms增加到370.19±10.29 ms．所占峰面積比例從2.34%±0.08%
減少到1.49%±0.04%。
由圖2可知，當新鮮蛋黃經(jīng)堿處理后，蛋白質(zhì)變性而形成凝膠，其結(jié)合水峰往左偏移，馳豫時間減小，表明體系中的結(jié)合水相鍵合力更強，水中的氫質(zhì)子自由度小，受束縛較大，但所占峰面積比例顯著下降(p<0.05)；其不易移動水峰和自由水峰均向右偏移，馳豫時間增大，表明體系中的不易流動水和自由水的流動性增強，并且不易流動水所占峰面積比例顯著升高(p<0.05)，同時自由水所占峰面積比例顯著降低(p<0.05)，表明蛋黃在堿誘導(dǎo)凝膠過程中，
變性蛋白質(zhì)分子通過水合作用交聯(lián)吸附體系中的水填充在三維凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，使較多的自由水轉(zhuǎn)變成不易流動水。隨著處理組NaOH含量的提高，蛋黃凝膠的結(jié)合水峰、不易流動水峰和自由水峰均向右偏移，馳豫時間增大，表明凝膠體系水中的氫質(zhì)子自由度較大，受束縛較小。其中，不易流動水所占峰面積比例無顯著差異(p>0.05)，自由水所占峰面積比例明顯
降低(p<0.05)，結(jié)合水所占峰面積比例顯著升高(p<0.05)，表明1.2%NaOH處理組蛋黃凝膠形成過程中更多的自由水通過水合作用與變性的蛋白質(zhì)分子交聯(lián)，并填充在凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)合水，增強蛋黃凝膠體系的品質(zhì)特性。
3結(jié)論
蛋白凝膠中的結(jié)合水是與蛋白質(zhì)大分子緊密結(jié)合或參與大分子組成的那部分水，烘干法無法除去這部分水。因此，通過烘干法測定的水分含量為蛋白凝膠中自由水與不易流動水的總含量。通過試驗發(fā)現(xiàn)，T2可以反映蛋清和蛋黃堿誘導(dǎo)凝膠的水分狀態(tài)和組成，再結(jié)合低場核磁共振成像技術(shù)測定蛋白凝膠的質(zhì)子密度就可以反映蛋白凝膠的水分分布，從而綜合分析肌原纖維蛋白凝膠保水性和凝膠中的水分組成、分布及含量。同時與傳統(tǒng)干燥法的測定結(jié)果進行對比分析，發(fā)現(xiàn)低場核磁共振技術(shù)與傳統(tǒng)技術(shù)的測定結(jié)果高度吻合。
綜上所述，低場核磁共振技術(shù)可以方便、快捷、準確、無損地測定蛋清和蛋黃堿誘導(dǎo)凝膠的保水性，水分組成、分布及含量。因此，試驗為低場核磁共振技術(shù)在蛋白凝膠及凝膠類制品中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。應(yīng)用LF-NMR檢測分析蛋清蛋黃堿誘導(dǎo)凝膠的水分分布狀態(tài)、流動性及其與相關(guān)食用品質(zhì)、特性間的相關(guān)性等，從而快速、動態(tài)地預(yù)測和控制鴨蛋制品的質(zhì)量已經(jīng)具有一定的技術(shù)可行性。
