關(guān)于巴山冷杉黃酮的提取鑒定及其抗氧化性研究
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作者：張毅
巴山冷杉枝葉中含有黃酮類、生物堿、有機(jī)酸、類和鞣質(zhì)、糖及苷類、酚蒽醌等成分，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。為了合理地利用巴山冷杉資源，試驗(yàn)進(jìn)行了巴山冷杉黃酮提取、種類鑒定及抗氧化性初步研究。
1 材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
1.1.1試驗(yàn)材料
巴山冷杉枝葉于2014年7月中旬采自陜西省太白林業(yè)局黃柏塬林場。將針葉陰干、粉碎、過10目篩裝袋備用。
1.1.2儀器與設(shè)備
AUY220電子天平：蘇州豐盛電子科技有限公司；FW200高速萬能粉碎機(jī)：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；KQ-500VDE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；UV-3100紫外一可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；ZF-1三用紫外分析儀：天津科諾儀器設(shè)備有限公司。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用Excel軟件分析得回歸方程為A=15.33C-0.008（C為蘆丁質(zhì)量濃度，mg/m L;A為吸光度），R2=0.999 3，線性范圍為0～0.045 mg/m L。同樣方法測定提取液中黃酮顯色反應(yīng)的吸光度，通過回歸方程計(jì)算巴山冷杉中黃酮的含量。
1.2.2巴山冷杉黃酮提取方法
將針葉陰干，粉碎，過10目篩裝袋備用。稱取粉末0.5 g于錐形瓶中，加不同料液比的乙醇水溶液，在不同功率、不同溫度下超聲不同時(shí)間后，將提取液真空抽濾，收集濾液定容至50 m L。吸取濾液1 m L于25m L容量瓶中進(jìn)行亞硝酸鈉一硝酸鋁顯色反應(yīng)，30 min后10 000 r/min下離心15 min，測定510 nm下上清液的吸光度。
1.2.3單因素試驗(yàn)
選擇超聲溫度、超聲功率、超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比5個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。各因素的水平梯度分別設(shè)置為：超聲溫度：25℃，35℃，45℃，55℃，65℃和75℃；超聲功率：200，300，400和500 W;超聲時(shí)間：20，30，40，50，60和70 min；乙醇體積分?jǐn)?shù)：30%，40%，50%，60%，70%，80%和90%；料液比：1：10，1：20，1：30，1: 40和1：50( g/m L)。
1.2.4響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)
參照單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert 8.06，Box-Benhnken( BBD)設(shè)計(jì)，確定料液比為1：20(g／m L)，以超聲溫度、超聲功率、超聲時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)4因素為自變量，以黃酮提取率為響應(yīng)值，通過4因素3水平的響應(yīng)面分析法對巴山冷杉黃酮的超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。
1.2.5 巴山冷杉中黃酮類化合物的鑒別
利用顏色反應(yīng)鹽酸-鎂法、草酸和濃硫酸法、四氫硼鈉法、硝酸鋁法以及氫氧化鈉法，對提取液中黃酮類化合物種類進(jìn)行鑒別。
1.2.6巴山冷杉黃酮抗氧化性測定
1.2.6.1 巴山冷杉黃酮對DPPH自由基清除能力的測定
參照Gurpreet Kaur( 2006)，反應(yīng)體系改為2m L 0.1 mg/mL DPPH和2 m L樣品，以槲皮素和VC作為標(biāo)準(zhǔn)物。清除率計(jì)算公式如下：
1.2.6.2 巴山冷杉黃酮對ABTS自由基清除能力的測定
參照Perumal Siddhuraju (2006)，稍加改動(dòng)為反應(yīng)體系100 VL待測液加3.9 m L預(yù)熱至37℃的ABTS．+反應(yīng)液，以VC和槲皮素作為標(biāo)準(zhǔn)物。清除率計(jì)算公式如下：
2結(jié)果與分析
2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析
由圖1可知，巴山冷杉中黃酮類化合物有兩種形式：黃酮苷元和糖苷。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時(shí)，黃酮苷元的溶出量較低，糖苷的溶出量較多；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較高時(shí)，前者增加，后者減少。在50%～70%范圍內(nèi)，溶出的黃酮苷元和糖苷兩種形式的黃酮類化合物總量不變，出現(xiàn)平臺(tái)現(xiàn)象。從成本及能耗方面考慮，選擇最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%。
在65℃之前，黃酮提取率和溫度成正比關(guān)系，達(dá)到峰值后趨于穩(wěn)定。高溫加強(qiáng)了黃酮的溶解和擴(kuò)散，加快了其溶出的速度，但隨著溫度的繼續(xù)增高，黃酮可能被氧化破壞，同時(shí)從能耗角度考慮，選擇溫度為65℃為宜。
在超聲功率為200～300 W功率范圍內(nèi)，功率的增加加速了細(xì)胞壁的破裂和溶劑的滲入，黃酮提取率隨之提高；當(dāng)提取率在300 W達(dá)到最高值后，繼續(xù)增加功率，提取率反而下降。這是由于此時(shí)氣泡數(shù)量雖然增加但爆破沖擊力減弱，致使空化作用減弱。同時(shí)過高的功率造成局部高溫，可能對黃酮化合物結(jié)構(gòu)造成破壞。因此，最適超聲功率為300 W。
黃酮提取率與超聲時(shí)間呈近拋物線變化規(guī)律。在20～40 min范圍內(nèi)，兩者呈正比關(guān)系，提取率在40 min到達(dá)峰值后，兩者又近似反比。因此，超聲波提取以40 min為佳。
料液比為1：20( g/m L)時(shí)曲線達(dá)到峰值，說明1：20( g/m L)的料液比已足夠溶解有效成分，繼續(xù)增大料液比，提取率出現(xiàn)略微下降。綜合成本考慮，選擇1：20（g/m L）為最佳料液比。
2.2超聲提取巴山冷杉針葉黃酮工藝優(yōu)化
2.2.1 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果
采用響應(yīng)面BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。
利用軟件Design-Expert 8.06對表2所示數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到黃酮提取率Y(%)與編碼自變量A，B，C和D的回歸方程為：Y=4.80+0.042A+0.015B+0.027C+0.059D— 0.013AB—0.041AC— 0.019AD — 7.25×10-3BC-0.022BD— 0.038CD —-0.12A2—0.084B2—0.12C2—0.055D2.
通過對表3和圖2的分析可知，A，B，C和D四因素都是影響黃酮提取率的極顯著因素(p<0.01)，影響程度依次為D>A>C>B，與單因素試驗(yàn)結(jié)果基本一致。4個(gè)因素的交互作用中，AC、AD、BD和CD的交互作用對提取率影響為極顯著，其他交互作用均不顯著。
表3結(jié)果表明，試驗(yàn)所用回歸模型p< 0.01，為極顯著；失擬項(xiàng)p=0.366 2，不顯著；決定系數(shù)R2=0.992 3。綜上所述，巴山冷杉黃酮的提取率用該模型進(jìn)行分析和預(yù)測時(shí)，預(yù)測值和實(shí)際值誤差不大，結(jié)果可信。
2.2.2最佳超聲提取條件的確定及驗(yàn)證
通過軟件分析得到，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，巴山冷杉黃酮提取率最高可達(dá)4.821%，最佳提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)55.18%，超聲溫度66.25℃，超聲功率300.88W，超聲時(shí)間40.10 min。在實(shí)際操作中，將工藝條件修正為：乙醇體積分?jǐn)?shù)55%，超聲溫度66℃，超聲功率300 W，超聲時(shí)間40 min，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，得黃酮提取率的實(shí)測值為4.817%，與理論預(yù)測值誤差為0.004%，說明響應(yīng)面法優(yōu)化模型能較好的預(yù)測巴山冷杉中黃酮含量，所得工藝條件比較可靠。
2.3 巴山冷杉中黃酮類化合物的鑒別
表4結(jié)果顯示：提取液中加入濃硫酸后變?yōu)槌壬}酸一鎂粉反應(yīng)和四氫硼鈉反應(yīng)均顯紅色，證明提取液中有二氫黃酮存在；浸有提取液的濾條上噴施硝酸鋁溶液和氫氧化鈉溶液，在紫外燈下觀察分別由黃綠色熒光和深黃色熒光，說明有黃酮醇；噴施草酸，紫外燈下觀察有黃色熒光，說明有查爾酮。綜上所述，巴山冷杉中含有二氫黃酮，黃酮醇類和查爾酮。
2.4 巴山冷杉黃酮抗氧化性測定
2.4.1 巴山冷杉黃酮對DPPH自由基清除能力的測定
由圖3可知，對DPPH自由基的清除能力VC>槲皮素>巴山冷杉。樣品濃度較低時(shí)，巴山冷杉黃酮清除DPPH自由基的能力略高于VC，近似于槲皮素。隨著樣品濃度的增加，清除率快速提高，當(dāng)濃度達(dá)到30ug/m L時(shí)平緩上升，50 ug/m L時(shí)趨于穩(wěn)定。經(jīng)計(jì)算得
VC的半數(shù)抑制濃度(IC50) =13.34，槲皮素的IC50為11.37，巴山冷杉黃酮的IC50=18.99，由此可見，巴山冷杉黃酮對DPPH自由基有一定的清除能力。
2.4.2巴山冷杉黃酮對ABTS自由基清除能力的測定
如圖4所示，巴山冷杉黃酮對ABTS．+的清除率約為86%。0~100 ug/m L范圍內(nèi)，增加樣品濃度，提取液對清除ABTS．+的能力也逐漸增強(qiáng)。當(dāng)樣品濃度達(dá)到100ug /m L，清除率趨于穩(wěn)定，且提取液的清除率小于VC和槲皮素。經(jīng)計(jì)算得VC的IC50=11.76，槲皮素的IC50=12.13，巴山冷杉黃酮的IC50=27.70。
3結(jié)論與討論
1)目前提取植物黃酮的主要方法有溶劑提取法，微波提取法，超聲波提取法，酶解法，超臨界流體萃取法等。應(yīng)用超聲波提取植物有效成分具有操作便捷，提取率高，時(shí)間短速度快等優(yōu)點(diǎn)。通過響應(yīng)面法分析超聲波提取得到巴山冷杉針葉黃酮的最佳工藝為超聲溫度66℃，超聲時(shí)間40 min，超聲功率300 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)55%，在此條件下黃酮實(shí)際提取率達(dá)到4.817%。
2)目前從冷杉屬植物中分離出的黃酮類物質(zhì)共有24種，通過顏色反應(yīng)，初步鑒定出巴山冷杉針葉中含有二氫黃酮、黃酮醇類、查爾酮等黃酮類化合物，然而作為我國特有樹種，能否從巴山冷杉中分離出新物質(zhì)還有待進(jìn)一步探究。
3)黃酮是多數(shù)植物的主要抗氧化物質(zhì)，對諸如炎癥、動(dòng)脈硬化、老年癡呆癥、帕金森癥等由活性氧引起的，自由基生成一清除體系不平衡導(dǎo)致的疾病具有緩解和修復(fù)等作用。其結(jié)構(gòu)中B環(huán)上的3’，4’-0--羥基基團(tuán)，C環(huán)上與4-酮基基團(tuán)結(jié)合的2，3-雙鍵以及3-羥基基團(tuán)，B環(huán)上的3’，4’,5’一三羥基基團(tuán)和擁有半個(gè)沒食子酸結(jié)構(gòu)對黃酮類物質(zhì)抗氧化能力貢
獻(xiàn)最大。試驗(yàn)表明，黃酮提取液對DPPH自由基，ABTS自由基均具有較好的清除作用，清除率分別為66.5%和86.8%。但是提取液中哪種結(jié)構(gòu)成分對抗氧化能力貢獻(xiàn)大有待更深層次的探究。
3摘要 以巴山冷杉針葉為原料，采用超聲波法和比色法等研究黃酮類化合物的提取工藝與黃酮種類鑒別，并對其進(jìn)行體外抗氧化能力測試。結(jié)果表明影響黃酮提取率大小的因素由大到小依次為：乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲溫度>超聲功率>超聲時(shí)間。超聲波法提取巴山冷杉針葉黃酮的最佳工藝條件為；乙醇體積分?jǐn)?shù)55%、超聲溫度660C、超聲功-300 W、超聲時(shí)間40 min。在此條件下黃酮提取率可達(dá)4.817%。巴山冷杉針葉中的黃酮類物質(zhì)主要為二氫黃酮、黃酮醇和查爾酮。巴山冷杉針葉黃酮提取液對DPPH自由基和ABTS自由基均具有較好的清除作用，清除率分別為66.5%和86.8%。
