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作者：鄭曉敏

    目前關(guān)于ERa的研究相對(duì)較多。ERa含595個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量約為66x103，包含5個(gè)結(jié)構(gòu)域，依次為不依賴配體激活的AFI、負(fù)責(zé)與靶基因啟動(dòng)子的雌激素反應(yīng)元件(estrogen receptor elements，ERE)特異結(jié)合的DNA結(jié)合域(DNA binding do-main，DBD)、核定位信號(hào)的鉸鏈區(qū)、配體結(jié)合功能區(qū)（ligand-binding domain，LBD）和配體依賴轉(zhuǎn)錄的AF2，以及功能不詳?shù)目勺儏^(qū)。ERa常發(fā)生翻譯后修飾，如磷酸化、泛素化、甲基化、乙酰化、SUMO、棕櫚化，其中以磷酸化最為常見(jiàn)�，F(xiàn)已報(bào)道的ERa磷酸化位點(diǎn)有十幾個(gè)，其中研究比較透徹的有7個(gè)，為S104、S106、S118、S167、S236、S305及Y537。不同區(qū)域磷酸化對(duì)ERa的作用也不同，如DBD區(qū)的S236位點(diǎn)在蛋白激酶A作用下發(fā)生磷酸化，從而抑制ERa_聚化形成，阻斷其與DNA的結(jié)合；而由Src酪氨酸激酶介導(dǎo)的Y537磷酸化主要調(diào)節(jié)ERa與E2的結(jié)合能力。這些翻譯后修飾常常調(diào)節(jié)ERa與ERE的結(jié)合，從而激活或抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄，包括c- myc、BCL-2、Bcl-XL、Cvc:lin Dl、IL-8，這些下游基因與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。因此，ERa翻譯后修飾常為乳腺癌研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

    本課題組前期在乳腺癌相關(guān)研究中，通過(guò)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)在ERa DBD區(qū)224位蘇氨酸(T224)和可變區(qū)559位絲氨酸(S559)發(fā)生磷酸化。雖然559位絲氨酸發(fā)生磷酸化已有報(bào)道，但對(duì)其研究尚少，而224位蘇氨酸磷酸化尚無(wú)報(bào)道。為此，我們構(gòu)建了ERa 224位蘇氨酸、559位絲氨酸磷酸化突變點(diǎn)載體，通過(guò)螢光素酶報(bào)告基因方法檢測(cè)這些突變位點(diǎn)對(duì)ERa活性是否產(chǎn)生影響。

1  材料與方法

I.I材料

    HEK293T細(xì)胞、感受態(tài)大腸桿菌DH5a、pRL質(zhì)粒、ERF啟動(dòng)子的螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(ERE-luc)及pcDNA3-Flag均為本實(shí)驗(yàn)室保存；真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-Flag-ERa為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；引物合成及測(cè)序由奧科鼎盛生物技術(shù)公司完成；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶等購(gòu)自TaKaRa公司；高保真Pfu DNA聚合酶、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)白Tiangen公司；螢光素酶活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自Pro-mega公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco生物公司；胎牛血清購(gòu)自杭州江濱公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE2000購(gòu)白Invitrogen公司；鼠抗Flag抗體購(gòu)自SantaCruz公司；雌激素、HRP標(biāo)記的鼠抗微管蛋白抗體購(gòu)自Sigma公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司。

1.2擴(kuò)增突變片段

    利用重組PCR擴(kuò)增ERa( T224A)、ERa(S559A)突變片段，即ACC突變?yōu)镚CC、TCC突變?yōu)镚CC。根據(jù)ERa基因序列及點(diǎn)突變需要設(shè)計(jì)引物（表1），由奧科鼎盛生物技術(shù)有限公司合成。

    以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存的野生型ERcc質(zhì)粒為模板，用相應(yīng)的引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增出含有點(diǎn)突變的上、下游目的基因片段（擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，68C延伸90 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；68。C延伸7 min），經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及上、下游片段回收，以等摩爾比例的上、下游配對(duì)片段為共同模板，利用搭橋法進(jìn)行二次PCR（擴(kuò)增條件：950C預(yù)變性5 min; 95℃變性30 s，55℃退火30 s，68C延伸120 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；68C延伸7 min)，擴(kuò)增出點(diǎn)突變的全長(zhǎng)目的基因片段。

1.3構(gòu)建磷酸化位點(diǎn)突變載體

    把全長(zhǎng)點(diǎn)突變片段、pcDNA3-Flag質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶BamH I /EcoR I于37。C雙酶切過(guò)夜，利用瓊脂糖凝膠電泳回收酶切片段和質(zhì)粒，再以6：1（片段：質(zhì)粒）的比例混合，室溫連接10 min后把連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a．在氨芐西林培養(yǎng)板上于37℃培養(yǎng)過(guò)夜，篩選陽(yáng)性克隆，以陽(yáng)性克隆為模板再次行PCR，確定重組質(zhì)粒上含有目的基因片段后，送奧科鼎盛生物科技有限公司測(cè)序。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

    用含10%胎牛血清、200 U/mL青霉素、200 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在5% CO2、37。C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至10 mm培養(yǎng)皿的60%-80%時(shí)用于轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前th更換4 mL新鮮培養(yǎng)基。先把4 μg構(gòu)建的質(zhì)粒、4μL轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE 2000分別加入200 μL生理鹽水中混合，靜置5 min，把混有轉(zhuǎn)染試劑的生理鹽水加入混有質(zhì)粒的生理鹽水中，靜置15 min，均勻地加入培養(yǎng)基中，4h后補(bǔ)4-6 mL新鮮培養(yǎng)基。

1.5免疫印跡分析

    轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，加入SDS上樣緩沖液（50  mmol/L  Tris- HCI  pH6.8，0.1%溴酚藍(lán)，2%SDS，1 0%甘油，2.5%β一巰基乙醇），沸水浴10 min，離心1 0 min后取上清進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h或4℃過(guò)夜，然后加入稀釋的Flag抗體，室溫孵育l h或4℃孵育過(guò)夜；用lxTBST冼膜3次，每次5 min，再加入稀釋的帶有辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG，室溫孵育l h，再次用lxTBST洗膜3次，每次5 min，然后將含有辣根過(guò)氧化物酶底物的ECL滴加至膜上，隨即在暗室中壓片顯影。

1.6螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

    把HEK293T細(xì)胞接種到6孔板培養(yǎng)，用無(wú)指示劑的白色DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，等長(zhǎng)至60%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)組設(shè)立分別為：①pcDNA3-Flag（1μg/孔）；②pcDNA3-Flag-ERa質(zhì)粒（1μg/孔）；③pcDNA3-Flag-ER儀( T224A)突變質(zhì)粒（1μg/孔）；④pcDNA3-Flag- ERa (S559A)突變質(zhì)粒（1μg/孔）。以f組均與ERE-luc質(zhì)粒（0.8 μg/孔）、pRL質(zhì)粒（0.008μg/孔）共轉(zhuǎn)，培養(yǎng)基中加入或不加入雌激素(10 nmol/l．)，共8組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后進(jìn)行螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)。先用lxPBS洗滌細(xì)胞2次，再向各孔中加入100 μL細(xì)胞裂解緩沖液，室溫輕搖15 min，把細(xì)胞裂解物收集到1.5 mL離心管中，4℃、12 000 r/min離心5 min，取30 μL上清用于螢光素酶活性測(cè)定。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。顯著性概率水平定為P<0.05。

2結(jié)果

2.1  ERa T224A．S559A突變基因片段的擴(kuò)增

    以pcDNA3-Flag-ERa質(zhì)粒為模板，通過(guò)重組PCR擴(kuò)增點(diǎn)突變的上、下游片段。經(jīng)電泳鑒定(圖1)，T224A上、下游片段為600-1000 bp，S559A上游約1700 bp，下游約100 bp;再以配對(duì)上、下游片段為共同模板，二次PCR擴(kuò)增出全長(zhǎng)的突變基因片段，均約1800 bp。

2.2  ERa T224A、S559A突變質(zhì)粒構(gòu)建

    將T224A、S559A突變體擴(kuò)增產(chǎn)物和pcDNA3-Flag質(zhì)粒均用Ba.mH I lEcoR I雙酶切，回收，連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a，用氨芐西林培養(yǎng)板培養(yǎng)。以陽(yáng)性克隆菌液為模板，重復(fù)PCR檢測(cè)質(zhì)粒中是否含有目的基因片段。電泳結(jié)果如圖2，PCR產(chǎn)物約1800 bp，證明質(zhì)粒上含有目的基因片段。測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證明插入片段為ERa突變體片段（序列略）。

2.3  Western印跡檢測(cè)ERa突變體的表達(dá)

    分別將pCDNA3-Flag-ERa、pcDNA3-Flag-ERa(T224A)、pcDNA3-Flag-ERa( S559A)及對(duì)空載體對(duì)照pcDNA3-F'Iag質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，用抗Flag抗體檢測(cè)pcDNA3-Flag-FRa(T224A)．pcDNA3-Flag-ERa( S559A)的表達(dá)，West-ern印跡結(jié)果如圖3。與空載體對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3-Flag-ERa、pcDNA3-Flag-ERa( T224A)和pcDNA3-Flag-ERa (S559A)的細(xì)胞，均顯示有一條相對(duì)分子質(zhì)量約66x103的特異性條帶，與預(yù)期大小吻合，說(shuō)明pcDNA3-Flag-ERa、pcDNA3-Flag-ERa(T224A)、pcDNA3- Flag- ERa( S559A)在：HEK293T細(xì)胞中均獲得良好表達(dá)。

2.4  螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)突變體活性

    將pcDNA3-Flag、pcDNA3-Flag-ERa、pcDNA3-Flag-ERa( T224A)、pcDNA3-Flag-ERa( S559A)分別與ERE-Iuc和pRL共轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞，用無(wú)指示劑的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，行螢光素酶活性檢測(cè)，結(jié)果如圖4。無(wú)雌激素時(shí)，pcDNA3-Flag-ERa、pcDNA3-Flag-ERa (T224A)和pcDNA3-Flag-ERa( S559A)的活性分別是pcDNA3- Flag的1.94，1.49和1.84倍(P<0.05)；與pcDNA3-Flag-ERa(T224A)相比，pcDNA3-Flag-ERa和pcDNA3-F'Iag-ERa (S559A)的活性明顯減低(P<0.05)，pcDNA3-Flag- ERa( S559A)與pcDNA3- Flag- ERa的活性差異不顯著(P<0.05)。有雌激素時(shí)，pcDNA3-Flag活性增加了0.54倍，pcDNA3- Flag- ERa活性增強(qiáng)了1.57倍pcDNA3-Flag-ERa (T224A)和pcDNA3-Flag-ERa( S559A)活性分別增強(qiáng)了0.54和0.61倍，說(shuō)明在雌激素作用下，pcDNA3-Flag-ERa活性增強(qiáng)明顯高于pcDNA3- Flag- FRa( T224A)和pcDNA3-Flag-ERa( S559A) (P<0.05)。因此，在HEK293T細(xì)胞中，224位蘇氨酸的磷酸化修飾對(duì)ERa活性起著重要的作用，同時(shí)2個(gè)磷酸化位點(diǎn)對(duì)雌激素調(diào)節(jié)ERa的活性也發(fā)揮重要作用。

3討論

    ERa與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和治療效果密切相關(guān)，因此乳腺癌的內(nèi)分泌治療主要以ERa介導(dǎo)的通路為靶點(diǎn)，如氟維司群(fulvestrant)抑制ERa的表達(dá)；他莫昔芬( tamoxifen)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ERa，減少雌激素與ERa結(jié)合。但在臨床上內(nèi)分泌治療常常出現(xiàn)耐藥性，這些耐藥性常與翻譯后修飾有關(guān)，其中以磷酸化最為常見(jiàn)，因此，研究ERa的磷酸化對(duì)探討耐藥機(jī)制及藥物開(kāi)發(fā)都有重要意義。

    有關(guān)ERa磷酸化的研究很多，已報(bào)道有十幾個(gè)磷酸化位點(diǎn)分布在各個(gè)區(qū)域，其中研究較透徹的位點(diǎn)有7個(gè)，包括AF1區(qū)的S104、S106、S118、S167．DBD區(qū)的S236，LBD區(qū)的S305及AF2區(qū)的Y537。前期我們通過(guò)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，ERa在DBD區(qū)的224位蘇氨酸和可變區(qū)的559位絲氨酸發(fā)生磷酸化，而目前關(guān)于559位絲氨磷酸化的研究甚少，而224位蘇氨酸磷酸化的研究尚無(wú)報(bào)道。我們通過(guò)構(gòu)建ERa224位蘇氨酸、559位絲氨磷酸化位點(diǎn)突變體，利用螢光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)法檢測(cè)其活性的改變，發(fā)現(xiàn)224位蘇氨酸突變體活性減弱，而559位絲氨突變體對(duì)雌激素調(diào)控減弱。這可能與224位蘇氨酸處于DBD區(qū)有關(guān)，該區(qū)主要負(fù)責(zé)與靶基因啟動(dòng)子的ERE結(jié)合，發(fā)生突變后可能與ERE的結(jié)合能力減

弱，從而使ERa活性減弱�？勺儏^(qū)功能研究尚未清楚，因結(jié)構(gòu)上與AF2區(qū)相鄰，可能與AF2區(qū)有相似的依賴配體調(diào)節(jié)ERa活性功能。因此，可變區(qū)的559位絲氨突變后，ERa也發(fā)生受雌激素調(diào)控減弱，但需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證�？傊�，ERa磷酸化位點(diǎn)突變體的構(gòu)建及其活性的檢測(cè)，對(duì)ERa的研究有重要意義，對(duì)乳腺癌的研究也可提供一定的幫助。

4[摘要]  目的：構(gòu)建雌激素受體a(ERa)T224A和S559A磷酸化位點(diǎn)突變體載體，在HEK293T細(xì)胞中檢測(cè)其表達(dá)及突變體生物活性的改變。方法：以pcDNA3-Flag-ERa為模板，通過(guò)重組PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因片段并突變堿基，插入pcDNA3-Flag載體；將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，通過(guò)Western印跡檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)，采用螢光素酶報(bào)告基因方法檢測(cè)ERct突變體的活性改變。結(jié)果：T224A和S559A磷酸化位點(diǎn)突變體在HEK293T細(xì)胞中得到表達(dá)，相對(duì)分子質(zhì)量為66x103。在無(wú)雌激素(E：)時(shí)，野生型ERa及T224A和S559A突變體的轉(zhuǎn)錄活性分別為空載體的1.94、1.49和1.84倍；在雌激素存在時(shí)，野生型ERcc活性增強(qiáng)了1.57倍，T224A和S559A突變體活性分別增強(qiáng)了0.54和0.61倍。結(jié)論：224位Thr磷酸化修飾對(duì)ERa的活性起重要作用，且2個(gè)磷酸化位點(diǎn)突變體受雌激素調(diào)控減弱