關于人自噬相關基因12真核表達載體的構建及表達的研究
作者：鄭曉敏
研究發(fā)現(xiàn)自噬參與腫瘤、病原體免疫的過程，自噬可通過一系列機制將腫瘤細胞、入侵的病原體1等降解，其機制為，來自高爾基復合體或粗面內(nèi)質網(wǎng)的單層或雙層膜將抗原包裹后形成自噬泡，自噬泡的外膜與溶酶體膜融合，內(nèi)膜及其包裹的物質進入溶酶體腔，被溶酶體中的酶水解，從而維持機體穩(wěn)定。
ATG12可以和ATG5、ATG16結合形成復合物，該復合物參與自噬體的形成，在白噬過程中發(fā)揮重要作用。ATG3蛋白是一種泛素樣綴合酶，它和ATCIO是促進ATG8和ATC12泛素樣蛋白結合的2種F2樣酶。有文獻報道稱，在白噬過程中ATG12可與ATG3相互作用。鑒于ATG12在白噬中的重要作用，我們擬構建ATG12的真核表達載體，并驗證表達的myc-ATG12融合蛋白與ATG3的相互作用，為進一步研究ATG12與自噬的關系奠定基礎。
1 材料和方法
1.1材料
人胚腎293T細胞由本室傳代培養(yǎng)；pXJ-40-myc載體為本實驗室保存；Flag-ATG3質粒為本實驗室前期構建；VigoFect為威格拉斯生物技術有限公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、PCR試劑均購自TaKaRa公司；上、下游引物由北京賽百盛生物技術有限公司合成；質粒提取、膠回收、PCR回收試劑盒購自Promega公司；HRP標記的抗myc標簽鼠單克隆抗體( myc-HRP)和抗Flag標簽鼠單克隆抗體(Flag-HRP)購白Sigma公司；DMEM及小牛血清購自Gibco公司；測序由北京奧科生物技術有限責任公司完成。
1.2 mvc-ATG12重組質粒的構建與測序
以本實驗室保存的人乳腺文庫為模板，根據(jù)文獻報道…”的ATG12編碼序列合成上游引物（5'-CGCGATCCATGGCGGACGAGCCCCAGTCTG-3'）和下游引物（5'一CCGCTCGACTCATCCCCACGCCTGAGACTTGC-3')，PCR擴增人ATG12的編碼序列（擴增條件：95℃預變性5 min；95C變性30 s，600C退火30 s，720C延伸30 s，30個循環(huán)；720C延長7 min），用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。
用BamH I /Xho I雙酶切pXJ-40-myc載體，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收載體大片段；將PCR片段回收后再用BamH I lXho I酶切，形成帶有粘端的雙鏈，用T4DNA連接酶連接入pXJ-40-myc載體；轉化大腸桿菌DH5a，挑選克隆，振蕩培養(yǎng)并提質粒，用BamH I lXho I雙酶切鑒定，酶切鑒定正確的克隆送北京奧科生物公司測序。
1.3哺乳動物細胞轉染和Western印跡檢測
按常規(guī)方法進行轉染，用不含雙抗、含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將293T細胞接種于6cm皿中，接種量以轉染時細胞密度達80%為宜，培養(yǎng)24 h后進行轉染，轉染前1 h換液。將4μLVigoFect與200 μL NaCI混合，再將總量為10 μg的重組質粒與200 μL NaCl混合，然后將上述2種溶液輕輕混合，室溫放置15 min，加入6 cm皿中，并以同樣方法轉染空pXJ-40-myc載體作為對照，37℃、5% CO2常規(guī)培養(yǎng)，4-6 h換液。質粒轉染293T細胞24 h后收集細胞蛋白，加入2xSDS加樣緩沖液，煮沸10 min，高速離心2 min，取上清液進行SDS-PAGE后電轉移至硝酸纖維素膜上；用5%脫脂奶粉于4℃封閉過夜，加入用5%脫脂奶粉以1：5000稀釋的用HRP標記的抗myc標簽鼠單克隆抗體，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；用化學發(fā)光法顯色5 min，壓片顯影。
1.4免疫共沉淀檢測ATG12和ATC3的相互作用
將人胚腎293T細胞接種于6 cm皿中，用重組myc-ATG12與Flag-ATC3共轉染細胞，轉染后4-6h換液，常規(guī)培養(yǎng)24 h后收集細胞，加入中鹽(0.25mol/L) IP緩沖液后與myc- beads于4℃結合4-6 h，3000 r/min離心5 min，經(jīng)中鹽IP緩沖液再次漂洗后，加入與myc-bcads等量的2xSDS加樣緩沖液，煮沸10 min，12 000 r/min離心2 min，取上清液進行SDS-PAGE后電轉移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉于4℃封閉1 h，加入用5%脫脂奶粉以1：5000稀釋的用HRP標記的抗myc和Flag標簽鼠單克隆抗體，室溫輕搖l h，TBST洗膜3次，每次5 min，用化學發(fā)光法顯色，5 min后壓片顯影。
2結果
2.1 myc-ATC 12重組質粒的構建與鑒定
以實驗室保存的人乳腺文庫為模板，PCR擴增人ATG12的編碼序列，獲得約420 bp的DNA片段，與預期一致（圖1）。將PCR產(chǎn)物用BamH I IXhoI雙酶切后，與經(jīng)同樣雙酶切的pXJ-40-myc載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆提質粒，經(jīng)酶切鑒定，可切出2條長度分別約為5000和420 bp的條帶，而相應的空載體酶切只見大片段，符合預期結果（圖2）。測序結果表明，插入片段的DNA序列與人ATC12基因的編碼序列完全一致（數(shù)據(jù)略）。
2.2 Western印跡檢測mvc-ATG12在293T細胞中的表達
將構建的mvc-ATG12重組質粒和空載體分別轉染293T細胞，24 h后提取蛋白進行SDS-PAGE，Western印跡檢測myc-ATG12蛋白的表達。結果顯示，轉染重組質粒后，用mvc-HRP抗體能夠在相對分子質量約17x103處檢測到明顯的特異性條帶，而空載體則無條帶（圖3）。說明myc-ATG12重組蛋白在293T細胞中能夠正確表達。
2.3 免疫共沉淀檢測ATG12與ATG3的相互作用
根據(jù)文獻報道，ATG12可與ATG3蛋白相互作用。為進一步證實構建的myc-ATG 12重組質粒正確，且能夠表達正確的融合蛋白，將重組myc-ATG12質粒與Flag- ATG3質粒共轉染293T細胞，24 h常規(guī)培養(yǎng)后收集蛋白，免疫共沉淀分析觀察顯示，mvc-ATG12融合蛋白與Flag-ATG3蛋白具有相互作用，而myc空載體在同一位置無此條帶，表明ATG12與ATG3蛋白能夠在體內(nèi)特異地相互作用，而myc標簽不影響ATG12的結構及其生物學功能（圖4）。進一步證明構建的重組mvc-ATC 12質粒正確，且能夠正常表達。
3討論
自噬是一種普遍而又重要的生命現(xiàn)象，廣泛參與多種生理和病理過程，特別是與腫瘤發(fā)生密切相關。目前，自噬的調(diào)控作用被廣泛關注并加以研究，以求從分子水平上對腫瘤進行治療，從而達到根治的目的。針對ATG的調(diào)控是現(xiàn)在自噬研究的熱點。根據(jù)其在自噬過程的不同階段發(fā)揮作用的不同，可將ATG分為以下三類：一是ATGI-ATG11-ATG17- ATC20- ATG24- ATG29- ATC31和ATC13-ATC8復合體，二是ATG6-ATG14-Vps34-Vps15復合體，三是ATG12-ATC5-ATG16和LC3-II-PE泛素樣蛋白系統(tǒng)�？梢夾TG12與自噬體的形成密切相關。有研究顯示ATG12缺失的小鼠胚胎干細胞前自噬體結構和自噬體的數(shù)量明顯減少。
ATG12定位于細胞質和自噬體中，同時介導自噬和凋亡兩條通路，在自噬過程中和ATG5的結合是不可逆的，同時與ATC3的結合區(qū)域也有很多疑惑待解決。本實驗構建的myc-ATG 12在真核細胞中獲得了表達，且表達的融合蛋白能夠與ATG3蛋白相互作用。ATG12在真核細胞中的成功表達，是繼續(xù)深入研究其在自噬中的作用機制，以及探討其利用價值的基礎。
4[摘要] 目的：構建帶mvc標簽的自噬相關基因12(ATG12)的真核表達載體，獲得n．vc-ATC12融合蛋白。方法：以人乳腺文庫為模板，采用PCR技術擴增人ATG12編碼序列，將其插入pXJ-40-．nyc載體構建重組質粒，轉染人胚腎293T細胞，Western印跡檢測表達情況；將重組質粒與ATG3表達質粒共轉染293T細胞，免疫共沉淀法檢測二者的相互作用。結果：myc-ATC12真核表達質粒構建成功，轉染293T細胞后融合蛋白獲得表達，其相對分子質量約17xl03.可與Flag- ATC3結合。結論：構建并表達了帶mvc標簽的人ArlG12真核表達載體，為進一步研究ATG12在自噬中的功能奠定了基礎。
