關(guān)于人β肌動蛋白基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)和純化的研究
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作者：張毅
我們擬構(gòu)建帶GST標(biāo)簽的人β-actin基因質(zhì)粒，并純化出CST-β-actin融合蛋白，為進(jìn)一步研究β-actin的生理功能奠定基礎(chǔ)。
1 材料和方法
1.1材料
大腸桿菌DH5a、Rossate感受態(tài)，帶CST標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pCEX-KG為本室所有；限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶及PCR試劑購白TaKaRa公司；VigoFect購白威格拉斯生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、CST-Sepharose 4B珠子購白Pharmacia公司；PCR產(chǎn)物及酶切載體膠回收試劑盒購自北京天根生物科技有限公司；GST標(biāo)簽鼠單克隆抗體購自Sigma公司；引物由北京賽百盛生物技術(shù)有限公司合成；測序由北京博邁得生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。
1.2vp-actin編碼區(qū)基因的擴(kuò)增
從人乳腺基因文庫中提取目的基因3-actin，b-actin編碼序列引物已由文獻(xiàn)報道，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因編碼序列。
上游引物為5'-CGGGATCC ATGGATGATCATATCGCCGCGC-3'，
下游引物為5'-CGGAATTCCTACAAGCATTTCJCCGTGGACG-3'。
擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min; 95℃變性30 s，58C退火30 s，72℃ 伸70 s，30個循環(huán)；720C再延長5min。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，用DNA膠回收試劑盒回收日的片段。
1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及原核表達(dá)鑒定
用限制性內(nèi)切酶BamH I、EcoR I對PCR產(chǎn)物及帶CJST標(biāo)簽的載體進(jìn)行酶切；PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后直接用DNA膠回收試劑盒回收，酶切載體經(jīng)DNA膠檢測，成功切出后也以同樣方法回收；將酶切產(chǎn)物和載體加入含T4DNA連接酶的15μL體系中，于16℃連接儀上連接4h；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并涂于氨芐西林抗性LB板上，37℃培育12 h后挑選單克隆并提質(zhì)粒，再用BamH I、EcoR I雙酶切質(zhì)粒，鑒定正確的質(zhì)粒送北京博邁得生物公司測序。
1.4 融合蛋白GST-β-actin的小量誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定
將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rossate感受態(tài)細(xì)胞并涂于氨芐西林抗性LB板，37CC孵箱中培育16 h后挑取菌落，接種于氨芐西林抗性LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)4-6 h，至D600nm值為0.6-1.0時，加入IPTG（終濃度為1 mmol/L）進(jìn)行小量誘導(dǎo)表達(dá)。分別收集誘導(dǎo)前后的菌液離心，進(jìn)行SDS-PAGE和Western印跡檢測。
1.5融合蛋白的純化
挑選小量誘導(dǎo)表達(dá)的含GST-B—actin質(zhì)粒的Rossate菌和含GST空載體的Rossate菌，同時接種于5 mL氨芐西林抗性的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)約12 h，活化后按2%的比例轉(zhuǎn)接于200 mL氨芐西林抗性的LB液體培養(yǎng)基中，20qC振蕩培養(yǎng)至D600nm值為0.4-0.6時，加入IPTG至終濃度為0.1mmol/L，20。C繼續(xù)培養(yǎng)24 h以上。按Pharmacia公司提供的如下方法純化蛋白：離心收集菌體，去除上清后向沉淀中加入裂解液并重懸，超聲波破碎裂解后12 000 r/min離心收集上清，加入適量GST-Sepha-rose4B純化珠，于4℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合4 h后3000 r/min離心收集珠子，緩沖液洗脫未結(jié)合的蛋白后得到純化的融合蛋白，用SDS-PACE鑒定。
2結(jié)果
2.1A[3-actin編碼區(qū)基因的克隆
以人乳腺文庫為模板，按前述條件進(jìn)行擴(kuò)增，獲得約1100 bp的PCR產(chǎn)物（圖1）。
2.2 GST-(3-actin重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
用BamH I、EcoR 1分別對目的基因片段及帶CST標(biāo)簽的載體進(jìn)行酶切，在T。DNA連接酶的作用下將酶切后的片段及載體進(jìn)行連接，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆并提質(zhì)粒，雙酶切后DNA凝膠電泳可見約1100 bp的條帶（圖2），麗對照GST空載體經(jīng)雙酶切后無此條帶，表明人3-actin基因的編碼序列已插入帶GST標(biāo)簽的載體中。DNA測序結(jié)果顯示與已知序列一致，無突變發(fā)生（數(shù)據(jù)略）。
2.3 融合蛋白(;ST-(3-actin的小量誘導(dǎo)表達(dá)鑒定
將帶GST標(biāo)簽的空載體和GST-3-actin重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rossate，挑取克隆并培養(yǎng)，經(jīng)IPTG小量誘導(dǎo)，收集誘導(dǎo)前后的菌體行Western印跡，表明GST-(3-actin融合蛋白表達(dá)正確(圖3)。
2.4 融合蛋白GST-β-actin的純化
利用CJST-Sepharose 4B親和珠對GST-β-actin進(jìn)行純化，SDS-PACE結(jié)果顯示純化效果較好，獲得一定純度的GST-3-actin融合蛋白（圖4）。
3討論
在傳統(tǒng)意義上，(3-actin被認(rèn)為是一種結(jié)構(gòu)蛋白，能組成和維持細(xì)胞的形態(tài)。然而，現(xiàn)在的研究表明，β-actin還是一種信號分子，它是目前已知的所有蛋白中參與蛋閂間聯(lián)系最多的一種，在高級真核生物中，它至少與100多種不同的β-actin結(jié)合蛋白有聯(lián)系，再加之它在核苷酸水解、離子及大量β-ac-tin結(jié)合蛋白作用下能在G-actin與F-actin兩種形式間轉(zhuǎn)變的特性，使得β-actin在許多細(xì)胞功能中扮演重要角色。目前有研究表明，F(xiàn)-actin在信號傳導(dǎo)過程中有重大作用，主要體現(xiàn)在對大量信號通路的控制，如Hippo、Ras-MAPK、Pl3K及NF-KB通路，并日一單體形式的G -actin通過結(jié)合到MAL-MRTF轉(zhuǎn)錄因子成為信號傳導(dǎo)通路中的直接調(diào)控物質(zhì)，這些發(fā)現(xiàn)為β-actin在人體中的作用研究開辟了新方向，未來還有更多機(jī)理有待探究。β-actin作為細(xì)胞骨架的主要組成成分，在細(xì)胞與人體內(nèi)環(huán)境的聯(lián)系中發(fā)揮了重要作用。表皮粘著小帶是介導(dǎo)細(xì)胞間粘連的重要膜蛋白，它在腫瘤細(xì)胞的遷移中發(fā)揮不可替代的作用，研究發(fā)現(xiàn)β-actin可以與前者的胞內(nèi)區(qū)域結(jié)合，因此推測β-actin在腫瘤細(xì)胞遷移中有極其重要的作用。目前已知，β-actin的不同形式和動力學(xué)特征是導(dǎo)致細(xì)胞遷移過程中突起形成的重要因素，已有研究發(fā)現(xiàn)F-actin與遷移細(xì)胞的突起是共存的，它決定了遷移細(xì)胞的形態(tài)，并且提供細(xì)胞與細(xì)胞間及細(xì)胞與基質(zhì)間聯(lián)系時的表皮張力，但其具體作用方式及影響因素仍未知曉。
綜上，我們構(gòu)建了帶GST標(biāo)簽的β-actin重組原核表達(dá)載體，表達(dá)、純化得到融合蛋白。這有利于進(jìn)一步探討β-actin除了作為結(jié)構(gòu)蛋白以外的其他生物分子學(xué)方面的功能，也為研究β-actin在腫瘤細(xì)胞遷移中的作用奠定了實(shí)驗(yàn)學(xué)基礎(chǔ)。
4[摘要] 目的：構(gòu)建帶CST標(biāo)簽的人β肌動蛋白(b-ac:tin)基因的原核表達(dá)產(chǎn)物，純化出CST-β-actin融合蛋白，為探究β-actin的各項(xiàng)生理功能做準(zhǔn)備。方法：以人乳腺文庫為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增β-actin基因，將其連接到帶有GST標(biāo)簽的載體上，經(jīng)鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rossate感受態(tài)細(xì)胞，小量誘導(dǎo)表達(dá)后，利用CST-Sephd-rose 4B親和珠純化GST-β-actin融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE和Western印跡檢測。結(jié)果：目的基因經(jīng)PCR技術(shù)得以擴(kuò)增，將其與帶GST標(biāo)簽的載體連接后再經(jīng)雙酶切鑒定及測序后確認(rèn)構(gòu)建成功；轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rossate感受態(tài)后獲得小量誘導(dǎo)表達(dá)，純化出CST-β-actin融合蛋白，并證實(shí)其有生物活性。結(jié)論：構(gòu)建了人b-actin的原核表達(dá)載體，并獲得了(GST-β-actin融合蛋白。
