關(guān)于波茨坦短芽孢桿菌降解間甲酚和苯酚特性的研究
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作者：張毅
間甲酚( m-cresol)是苯酚的甲基取代物之一，但相比鄰甲酚和對甲酚更難降解，其毒性很高，即使在很低濃度下對生命體也有很嚴重的毒害作用，常伴隨苯酚出現(xiàn)在工業(yè)廢水中。因此，有效去除水中酚類化合物對保護水環(huán)境安全的意義不言而喻。
去除廢水中酚類化合物主要有物理化學法、化學法和生物法3類，生物法因經(jīng)濟和環(huán)境保護上的優(yōu)勢被越來越多地關(guān)注和研究。盡管酚類物質(zhì)有較高毒性，仍然發(fā)現(xiàn)有微生物能夠同時降解苯酚和間甲酚。葛啟隆等從處理焦化廢水的活性污泥中分離出一株苯酚高效降解菌，經(jīng)鑒定為波茨坦短芽孢桿菌（Brevibacillus borstelensis），苯酚降解能力達1 600mg/L。但是，波茨坦短芽孢桿菌降解間甲酚以及雙底物降解特性還未被研究。
本研究以波茨坦短芽孢桿菌為對象，考察其降解間甲酚的特性和生長動力學，并研究雙底物體系中，苯酚和間甲酚的相互影響和動力學，同時研究酚類物質(zhì)的降解途徑。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗菌株
波茨坦短芽孢桿菌（Brevibacillus borstelensis），本實驗室從處理焦化廢水的活性污泥中分離得到。
1.1.2 培養(yǎng)基
選擇培養(yǎng)基( g/L)：NH4N03 0.5，Na2HP04 7.9，KH,PO。1.5，MgS04·7H20 0.1，pH 7.0，微量元素溶液2 mL，苯酚和間甲酚利用0.2μm孔徑纖維膜過濾除菌，在接種前按需要量加入培養(yǎng)基中。
富集培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸出粉5，NaCI 10，pH 7.0。
以上培養(yǎng)基，所有的試劑（除苯酚和間甲酚），槍頭及帶有棉塞的錐形瓶用高壓蒸汽滅菌器在121℃滅菌20 min，固體平板和斜面培養(yǎng)基均在上述培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉。
1.2 實驗方法
1.2.1 降解實驗
菌株在富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期末期，取菌體離心分離，用pH 7.2的磷酸鹽緩沖液連續(xù)洗滌菌體兩次，再次離心去上清液，沉淀菌體重懸于pH 7.2的磷酸鹽緩沖液中，制成菌懸液。
按5%的接種量將菌懸液接種到50 mL含有苯酚/間甲酚的選擇培養(yǎng)基中，在30℃、160 r/min條件下培養(yǎng)，研究菌株生長和間甲酚降解特性，及苯酚和間甲酚的相互作用。每隔適宜時間取樣檢測培養(yǎng)液中的菌體含量和殘余苯酚/間甲酚含量。
1.2.2 酶活性測定
1.2.2.1 粗酶液的制備
取對數(shù)生長期后期菌液4℃高速離心5 min，棄上清液收集菌體。菌體用磷酸鹽緩沖液( pH=7.2，0.2mol/L)清洗2次，再次重懸于磷酸鹽緩沖液，置于冰水混合物中，用超聲破碎儀破碎細胞10 min(破碎30s，間歇30 s)。4℃、12 000 r/min下離心20 min，收集上清液，上清液即為粗酶液。
1.2.2.2 酶活力測定
(l)苯酚羥化酶活性測定。3 mL反應(yīng)體系中含苯酚4.5μmo1，NADPH 4.5μmol，粗酶提取液0.6mL，磷酸緩沖液250 μmol，pH=7.4，30℃水浴5min，在340 nm處測定的NADP+的生成速度來表征苯酚羥化酶的活性。一個單位的苯酚羥化酶的活性被定義為每分鐘氧化1μmo1/L NADPH所需的酶量。
(2)鄰苯二酚1，2-雙加氧酶(C120)活性測定。3 mL反應(yīng)體系中含鄰苯二酚1.5μmol，EDTA l.5μmol，粗酶提取液0.6 mL，磷酸緩沖液250 ymol，pH=7.4。30℃水浴5 min，在260 nm處測定的產(chǎn)物順，順一粘糠酸生成速度來表征Cl20的活性。一個單位的鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的活性被定義為每分鐘產(chǎn)生
1 μmol/L順，順一粘糠酸所需的酶量。
(3)鄰苯二酚2，3-雙加氧酶(C230)活性測定。3 mL反應(yīng)體系中含鄰苯二酚1.5μmol，粗酶提取液0.6 mL，250μmol磷酸緩沖液，pH=7.4。30℃水浴5min，在375 nm處測定的產(chǎn)物2一羥基粘糠半醛生成速度來表征C230的活性。一個單位的鄰苯二酚2，3-雙加氧酶的活性被定義為每分鐘產(chǎn)生lμmol/L 2-羥基粘糠半醛所需的酶量。
以上實驗結(jié)果為3次重復(fù)的平均值。
1.3 測定和分析方法
菌體濃度的測定采用光密度法和恒重干燥法，建立OD600和細胞干重的線性關(guān)系；苯酚和間甲酚濃度用高效液相色譜儀(HPIC)測定，色譜條件：AgilentXDB-Cl8分析色譜柱(4.6 mmx250 mm，5μm)，流動相甲醇：水(60:40)，流速1 mL/min，柱溫30℃，UV檢測波長270 nm；總蛋白含量用Bradford法測定，酶的比活力以每毫克的蛋白質(zhì)中所含酶的活力單位數(shù)計算。
2 結(jié)果與討論
2.1 間甲酚降解及動力學
2.1.1 波茨坦短芽孢桿菌對間甲酚的降解
細胞生長和間甲酚降解曲線如圖1所示。初始間甲酚濃度為200、300、400 mg/L，降解完所需時間分別為44、56、72 h。隨著底物濃度增大，細菌生長的延滯期增長，這表明底物濃度越高，其對菌體的抑制作用越強。間甲酚的消耗主要用于細胞生長和細胞能量代謝。從圖1可見，隨著間甲酚濃度的增加，最終細胞濃度也相應(yīng)提高。但是初始間甲酚濃度從200 mg/L增加到300 mg/L時，最終細胞濃度約增加了33.1mg/L，而從300 mg/L增加到400 mg/L時，最終細胞濃度只增加了12.2 mg/L。這是因為在高濃度下，底物對細胞生長的抑制作用增強，間甲酚更多地作為能源用于維持細胞活性，而不是用來合成細胞。
2.1.2 細胞生長動力學
菌體在不同間甲酚初始濃度下的比生長速率用公式(1)計算。
式(1)中，μ為細胞比生長速率(h-1)；yx為細胞生長速率；Cx為細胞濃度(mg/L)。
由于間甲酚對細胞生長有抑制作用，采用Hal-dane方程描述菌體降解間甲酚的動力學，見公式(2)。
式(2)中，μmax為細胞最大比增長速率(h-1)；S為限制性底物濃度( mg/L)；Ks為半飽和系數(shù)（mg/L）；Ki為底物抑制系數(shù)(mg/L)。
運用ORIGIN8.0軟件處理實驗數(shù)據(jù)，將細胞的比生長速率與對應(yīng)的初始底物濃度進行非線性最小二乘擬合得到動力學模型各參數(shù)：μnax =0.226 h-1，Ks=18.19 mg/L,K-130.12 mg/L(R2=0.991).μmax表示菌體利用底物的最大潛力，菌體降解間甲酚的μ一小于降解苯酚的(0.334 h_)，表明波茨坦短芽孢桿菌降解間甲酚的能力弱于對苯酚的降解。K越小，表明底物濃度較低時就會對細胞產(chǎn)生較強的抑制作用，菌體降解間甲酚的K小于降解苯酚的( 196.89 mg/L)，表明間甲酚對細胞生長的抑制作用更強。
從圖2可見，菌體的最大比生長速率出現(xiàn)在很低的間甲酚濃度。當間甲酚濃度40 mg/L時，最大比生長速率為0.127 h-1。之后，隨著間甲酚濃度增加，比生長速率下降。
2.2 雙底物降解及動力學
苯酚初始濃度為600 mg/L，間甲酚初始濃度為100-200 mg/L的雙底物降解特性如圖3所示。當間甲酚濃度為100 mg/L時，苯酚降解時間延長了8 h；但間甲酚濃度為200 mg/L時，600 mg/L苯酚降解所需時間增加38 h。間甲酚濃度越高，對苯酚降解的抑制作用越強烈。同理，苯酚的存在也延緩了間甲酚的降解。在含有600 mg/L苯酚的體系中，200 mg/L間甲酚降解增加30 h。盡管苯酚的濃度比間甲酚高，但菌體仍然優(yōu)先利用苯酚作為碳源和能源，間甲酚降解主要在整個降解過程的末期完成。
間甲酚初始濃度為200 mg/L，苯酚初始濃度為150-350 mg/L的雙底物降解特性如圖4所示。盡管高濃度苯酚對間甲酚降解有抑制作用，但低濃度的苯酚對間甲酚降解有促進作用。當體系中苯酚濃度150-300 mg/L時，200 mg/L間甲酚降解時間均會縮短，且200 mg/L是促進間甲酚降解的最佳苯酚濃度。苯酚相對間甲酚更容易被菌體利用，細胞代謝活性升高，間甲酚降解速率比沒有苯酚時的降解速率大。當苯酚濃度達到350 mg/L，苯酚對菌體的抑制作用開始發(fā)揮主要作用。在苯酚一間甲酚雙底物體系中，促進和抑制作用一直存在，兩者的競爭導(dǎo)致不同的降解速率。
由于苯酚、間甲酚存在交叉抑制并且都抑制細胞生長，本研究用Abuhamed等提出的方程描述苯酚一間甲酚雙底物體系細胞生長動力學，見式(3):
式(3)中，下標1表示苯酚，下標2表示間甲酚；μmax、Ksi和Kji均為單底物降解時的動力學參數(shù)；Iij表示底物i對底物j的抑制程度，數(shù)值越大表示抑制作用越大。基于雙底物降解實驗數(shù)據(jù)，用非線性最小二乘擬合得到，I 1.2=1.70，I 2.1=2.84，相關(guān)系數(shù)R2=0.89。結(jié)果表明，間甲酚對苯酚降解的抑制作用要強于苯酚對間甲酚降解的抑制。
2.3 酚類化合物降解途徑
鄰苯二酚雙加氧酶是芳香化合物代謝的關(guān)鍵酶。底物在苯酚羥化酶的催化下生成（取代的）鄰苯二酚，然后被鄰苯二酚1，2-雙加氧酶催化鄰位開環(huán)或者鄰苯二酚2，3一雙加氧酶催化間位開環(huán)，之后被進一步降解進入TCA循環(huán)。通過測定苯酚羥化酶、鄰苯二酚1，2一雙加氧酶和鄰苯二酚2，3-雙加氧酶的活性，可以初步推測波茨坦短芽孢桿菌菌株降解間甲酚的代謝途徑。波茨坦短芽孢桿菌粗酶活性檢測結(jié)果如表1所示。
從表1可知，波茨坦短芽孢桿菌在降解酚類化合物時，苯酚羥化酶和鄰苯二酚1，2-雙加氧酶表現(xiàn)出較高的比活力，而鄰苯二酚2，3-雙加氧酶幾乎沒有活性，因此推斷該菌株降解苯酚和間甲酚都遵循鄰位開環(huán)途徑。底物在苯酚羥化酶作用下轉(zhuǎn)化成（取代的）鄰苯二酚，接著在鄰苯二酚1，2-加氧酶催化下鄰位開環(huán)轉(zhuǎn)化成順，順一粘糠酸，進一步降解，最終生成琥珀酸CoA和乙酰CoA，進入TCA循環(huán)。這與Ren Yuan等研究Citrobacter farmeri獲得的實驗結(jié)論一致。
實驗數(shù)據(jù)表明，在間甲酚為單底物的降解體系中，苯酚羥化酶和鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的比活力明顯弱于降解苯酚時的比活力。降解體系中苯酚的存在提高了2種酶的比活力，結(jié)果再次證明了苯酚對間甲酚降解的促進作用。
3 結(jié)論
(1)波茨坦短芽孢桿菌能夠利用間甲酚作為唯一碳源和能源，最大降解能力達到400 mg/L，間甲酚濃度越高，對菌體抑制作用越強。細胞生長動力學(Hal-dane方程)參數(shù)為：μmax=0.226 h-1，Ks=18.19 mg/L，Ki=130.12 mg/L，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.991，實驗數(shù)據(jù)很好地符合Haldane方程。動力學方程參數(shù)表明，間甲酚對菌體的抑制作用要強于苯酚。
(2)在苯酚一間甲酚雙底物降解體系中，間甲酚抑制苯酚的降解，反之亦然。150-300 mg/L的苯酚能促進200 mg/L間甲酚的降解，縮短間甲酚降解時間，苯酚200 mg/L時，間甲酚降解速率最快。波茨坦短芽孢桿菌優(yōu)先利用苯酚作為能源和碳源。雙底物細胞生長動力學研究表明，間甲酚對苯酚降解的抑制要強于苯酚對間甲酚降解的抑制。
(3)苯酚和間甲酚在降解過程中遵循相同的降解途徑：底物在苯酚羥化酶作用下轉(zhuǎn)化成（取代的）鄰苯二酚，接著在鄰苯二酚l，2一加氧酶催化下鄰位開環(huán)轉(zhuǎn)化成順，順一粘糠酸，進一步降解，最終生成琥珀酸CoA和乙酰CoA，進入TCA循環(huán)。
4摘要：研究了波茨坦短芽孢桿菌降解間甲酚的特性及雙底物體系中苯酚和間甲酚的相互作用。結(jié)果表明，波茨坦短芽孢桿菌能在72 h內(nèi)降解400 mg/L的間甲酚，但其降解間甲酚的能力低于苯酚，擬合的Haldane方程各動力學參數(shù)為：μmax=0.226 h-1，Ks=18.19 mg/L,
K,=130.12 mg/L。在苯酚一間甲酚體系中，苯酚抑制問甲酚的降解，同樣間甲酚也抑制苯酚的降解；但是低濃度苯酚能促進間甲酚的降解，苯酚濃度150-300 mg/L時，能促進200 mg/L間甲酚的降解，苯酚200 mg/L時，間甲酚降解速率最快；動力學參數(shù)表明間甲酚對苯酚降解的抑制要強于苯酚對間甲酚降解的抑制。酶活測定表明，苯酚和間甲酚降解都遵循鄰位降解途徑：生成（取代的）鄰苯二酚，然后在鄰苯二酚1，2一雙加氧酶作用下鄰位開環(huán)裂解。
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