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     作者：張毅

研究表明，二氫楊梅素對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、鏈球菌、黑曲霉、綠膿桿菌、牛奶酸敗菌等均具有較好的抑菌效果，但關(guān)于二氫楊梅素抑菌機(jī)制的研究仍鮮見相關(guān)報(bào)道；藥物對細(xì)菌的抑制作用，主要是通過破壞細(xì)胞膜

及細(xì)胞壁的滲透性、抑制蛋白質(zhì)的合成和影響細(xì)菌的呼吸代謝等途徑來實(shí)現(xiàn)。試驗(yàn)率先研究了二氫楊梅素對金黃色葡萄球菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)和呼吸代謝的影響，為改善二氫楊梅素的抑菌性能及其定向改性提供理論依據(jù)，為開發(fā)純天然、毒副作用小、價(jià)格低廉的二氫楊梅素類的防腐劑和藥物奠定基礎(chǔ)。

1  材料與方法

1.1材料與設(shè)備

    二氫楊梅素，純度95%以上，實(shí)驗(yàn)室自制，簡稱DMY;金黃色葡萄球菌菌株，由南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院提供；磷酸鹽緩沖液( PBS)、乙醇、戊二醛：天津市福晨化學(xué)試劑廠；碘乙酸，丙二酸，磷酸鈉，六甲基二硅氨烷、四氧化鋨、醋酸異戊酯：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

    JSM-6701F冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡：日本電子株式會社；HA-80便攜式微量溶解氧儀：北京恒奧德儀器儀表有限公司；GNP9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；AL204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TGL-12C型臺式高速離心機(jī)：上海菲恰爾分析儀器有限公司；MLZ-HWY-2102C型恒溫振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；SW-CJ-ICU雙人單面垂直潔凈工作臺：蘇潔凈化設(shè)備有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1  DMY對細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

    采用掃描電鏡觀察DMY加入前后菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。具體步驟為：將培養(yǎng)24 h的金黃色葡萄球菌加入到含有DMY的肉湯培養(yǎng)基中(DMY質(zhì)量濃度為110 mg/L)，接種量5%，于搖床中培養(yǎng)(37℃．130 r/min)。從加DMY培養(yǎng)開始計(jì)時(shí)，每隔4，14，24 h分別取培養(yǎng)基中菌液3 mL，離心棄上清液(3 000r／min)，收集菌體，菌體沉淀用0.1 mol/L的PBS緩沖液洗滌3次。洗滌后的菌體沉淀用2.5%的戊二醛溶液固定，放入冰箱冷藏1~2 h后用PBS緩沖液沖洗，用1%的四氧化鋨固定1~2 h，使用PBS緩沖液再次沖洗。分別使用50%，70%和90%濃度的酒精各浸泡8 min，然后用100%酒精脫水10 min，用醋酸異戊酯浸泡30 min以上。將脫水后的菌體涂到金屬箔片上，用六甲基二硅氨烷( HMDS)干燥3 min，干燥好的菌體粉末用導(dǎo)電膠黏附噴金3～5 min，上機(jī)鏡檢觀察，記錄結(jié)果并拍照。正常未加DMY的金黃色葡萄球菌同上制備，作為對照組。

1.2.2  DMY對細(xì)菌呼吸代謝的影響

1.2.2.1  呼吸速率的測定

    呼吸速率是指單位時(shí)間、單位質(zhì)量微生物的耗氧量。在反應(yīng)杯中加入pH為7.2，濃度為0.1 mol/L的PBS緩沖液3.6 mL，1%葡萄糖溶液0.4 mL，含菌量106 CFU/mL的金黃色葡萄球菌菌液1 mL，露空攪拌5min，開始用微量溶解氧儀測定菌懸液中的溶氧量變化（計(jì)算初始呼吸速率R0），測定時(shí)保證整個(gè)系統(tǒng)處于密封狀態(tài)，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.2.2呼吸抑制率的測定

    用注射器分別加入三種典型抑制劑（丙二酸、碘乙酸和磷酸鈉，終質(zhì)量濃度為500 mg/L）和DMY（終質(zhì)量濃度為110 mg/L），加藥后封閉反應(yīng)系統(tǒng)，輕輕搖動反應(yīng)杯，用微量溶解氧儀測定加藥后菌液中溶氧量變化（計(jì)算末呼吸速率R1），計(jì)算得到呼吸抑制率IR。以不加抑制劑和DMY組為對照，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.2.3  呼吸疊加率的測定

    在反應(yīng)杯中加入pH為7.2，濃度為0.1 mol/L的PBS緩沖溶液3.6 mL，1%葡萄糖溶液0.4 mL，含菌量106 CFU/mL的金黃色葡萄球菌菌液1 mL，加入DMY使其終質(zhì)量濃度為110 mg/L，加入DMY后輕輕搖動反應(yīng)杯，保證整個(gè)系統(tǒng)密封，用微量溶解氧儀測定菌液中溶氧量變化（計(jì)算末呼吸速率R1），再分別加入三種典型抑制劑：丙二酸、碘乙酸、磷酸鈉，使終質(zhì)量濃度為500 mg/L，封閉系統(tǒng)，輕晃反應(yīng)杯，測菌液溶氧量變化（計(jì)算同時(shí)加入典型抑制劑和DMY后菌液的疊加呼吸速率R2），計(jì)算得到典型抑制劑對DMY的Ⅱ乎吸疊加率DR，重復(fù)試驗(yàn)3次，取平均值。呼吸抑制率和呼吸疊加率的計(jì)算公式為：

    式中，IR-呼吸抑制率；DR-呼吸疊加率，R0-初始呼吸速率；R1-分別加入抑制劑和DMY的末呼吸速率；R2-同時(shí)加入抑制劑和DMY的呼吸速率。

2結(jié)果與討論

2.1  DMY對菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

    DMY對金黃色葡萄球菌菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響見圖1。掃描電鏡下，正常作用4h后的細(xì)菌表面光滑，菌體飽滿，折光性好，見圖1(A)。而經(jīng)DMY作用4h后菌體表面開始產(chǎn)生褶皺，變得粗糙，見圖1 (B)。正常作用14 h后細(xì)菌依舊表面光滑，菌體飽滿，見圖

1(C)。而DMY作用14 h后的細(xì)菌開始皺縮，變得不飽滿，表面產(chǎn)生凹陷，囊泡和不規(guī)則突起狀結(jié)構(gòu)，見圖1(D)。正常作用24 h后細(xì)菌表面開始出現(xiàn)輕微粗糙，但并無異狀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生，整個(gè)菌體仍然飽和成型，見圖1(E)。而DMY作用24 h后細(xì)菌嚴(yán)重皺縮、干癟、扭曲變形，有的菌體已發(fā)生明顯萎縮并融為一體，見圖1(F)。由圖得知，DMY作用后的金黃色葡萄球菌，其菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)與對照組相比已經(jīng)發(fā)生了明顯的變化

2.2 DMY對細(xì)菌呼吸代謝的影響

    細(xì)胞分解葡萄糖主要有三種途徑：  (1) TCA: 有氧條件下，葡萄糖經(jīng)三羧酸循環(huán)( TCA)徹底氧化成水和二氧化碳；(2) EMP:無氧條件下，葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑( EMP)生成乳酸或乙醇；  (3)HMP:葡萄糖經(jīng)戊糖磷酸途徑提供呼吸代謝的中間產(chǎn)物。

    丙二酸、碘乙酸和磷酸鈉分別是TCA、EMP和HMP途徑的典型抑制劑。DMY抑制細(xì)菌呼吸代謝的具體途徑可通過比較3種典型抑制劑對DMY的呼吸疊加率來判斷，呼吸疊加率越小，表明DMY與典型抑制劑間的增效作用越弱，DMY與典型抑制劑抑制相同代謝途徑的可能性就越大。典型抑制劑和DMY對金黃色葡萄球菌的呼吸抑制率和呼吸疊加率的影響見表1和表2。

    結(jié)果表明，DMY同其它三種典型呼吸抑制劑一樣，對金黃色葡萄球菌的呼吸代謝具有抑制作用，且抑制效果明顯。同時(shí)，DMY對丙二酸的呼吸疊加率最小，對磷酸鈉的疊加率最大，這說明DMY主要是通過三羧酸循環(huán)( TCA)途徑來抑制整個(gè)菌體的呼吸代謝，具體的抑制部位和方法還需要進(jìn)一步研究。

3結(jié)論

    1) DMY作用后的金黃色葡萄球菌，其菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)與對照組相比有明顯的變化，菌體出現(xiàn)嚴(yán)重皺縮、干癟、扭曲變形等現(xiàn)象，說明DMY對菌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)有明顯的破壞作用。

    2) DMY同其他三種典型呼吸抑制劑一樣，對金黃色葡萄球菌的呼吸代謝具有抑制作用，且抑制效果明顯。DMY對丙二酸的疊加率最小，對磷酸鈉的疊加率最大，這說明DMY主要是通過三羧酸循環(huán)(TCA)途徑來抑制整個(gè)菌體的呼吸代謝，具體的抑制部位和方法還需進(jìn)一步研究。

3)率先從細(xì)菌形態(tài)及呼吸代謝的角度對DMY的抑菌機(jī)理行了初步探索，下一步將繼續(xù)從細(xì)胞滲透性、蛋白質(zhì)合成等方面進(jìn)行研究，然后在綜合試驗(yàn)結(jié)果和分析數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，確定DMY抑菌的關(guān)鍵靶點(diǎn)，進(jìn)而推測DMY的抑菌機(jī)制。

4、摘要

以金黃色葡萄球菌為供試茵，通過掃描電鏡觀察和呼吸抑制試驗(yàn)，研究二氫楊梅素對細(xì)菌形態(tài)及呼吸代謝的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，二氫楊梅素作用后的金黃色葡萄球菌，其茵體形態(tài)與對照組相比有明顯的變化，菌體出現(xiàn)嚴(yán)重皺縮、干癟、扭曲變形等現(xiàn)象。二氫楊梅素對金黃色葡萄球菌的呼吸代謝具有明顯的抑制效果，并主要通過三羧酸循環(huán)(TCA)途徑來抑制整個(gè)菌體的呼吸代謝，具體的抑制部位和方法還需進(jìn)一步研究。