思考與探索:川明參皂苷的大孔樹脂純化及其抑菌性研究
作者：鄭曉敏
目前，對川明參的研究主要集中在主要營養(yǎng)成分分析、多糖和香豆素提取等。試驗研究川明參皂苷的大孔樹脂純化及其抑菌性，以期為川明參的推廣和皂苷資源的挖掘提供另一途徑。
1材料及方法
1.1原料與試劑
川明參：四川省蒼溪縣龍山川明參合作社提供；D-301、D-101樹脂：鄭州勤實科技有限公司；X-5、AB-8、HPD-600、NKA-9、D-4020樹脂：上海華藍化學科技有限公司。
皂苷標準品：上海永葉生物科技有限公司；乙醇、甲醇、HC1、NaOH、硫酸、石油醚、香草醛、冰乙酸等：實驗室提供。
1.2試驗儀器與設備
HK-02型小型中藥粉碎機：湖南中誠制藥機械廠；FA1004型電子天平：鄭州華通實業(yè)有限公司；R5003旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：天津鑫源儀器儀表有限公司；754型紫外分光光度計：上海譜元儀器有限公司；FDGJ-0.5C型真空冷凍干燥機：南京瑪爾儀器設備有限公司。
1.3試驗方法
1.3.1大孔樹脂的預處理
大孔吸附樹脂→體積分數(shù)為95%乙醇浸泡溶脹→裝柱→體積分數(shù)為95%乙醇洗至流出液加水(1:5，V/V)不混濁→蒸餾水洗至無醇味→5% HC1溶液浸泡→ HC1溶液洗滌→蒸餾水洗至中性→2%NaOH溶液浸泡→2% NaOH溶液洗滌→蒸餾水洗至中性→抽濾→置于密閉容器備用
1.3.2川明參皂苷的提取與純化工藝流程
川明參→洗凈→粉碎→過篩→加體積分數(shù)為50%乙醇超聲提取3次→過濾→合并濾液→蒸干→加無水甲醇溶解→加15%硫酸回流→冷卻→石油醚萃取3次→合并萃取液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→甲醇→水（70：30，V/V）溶解→定容→精密吸取川明參供試液→上柱→大孔樹脂吸附→乙醇洗脫→收集→減壓濃縮→冷凍干燥→川明參皂苷
1.3.3川明參皂苷的測定
采用香草醛一冰乙酸比色法標準溶液配制：準確稱取花旗參皂苷標準品50.0 mg置于100 mL容量瓶中，溶解。分別取花旗參皂苷標準溶液0.1，0.3，0.6，1.0，1.8，2.4 mL于6只100 mL容量瓶中，定容。測定系列標準溶液的吸光度。經(jīng)統(tǒng)計回歸處理，得到線性方程為y=0.091 3x-0.076 3．R2=0.999 7，x指標準品的質(zhì)量濃度( mg/mL)，y指吸光度。
樣品測定：準確移取一定量的樣品溶液于容量瓶中，加3 mL 5%香草醛一冰乙酸溶液和1.0 mL高氯酸溶液作顯色液，搖勻，靜置。以空白試劑作參比，在590 nm波長處測其吸光度。
川明參皂苷純度=P1／W1×100% (1)
式中：P1-大孔樹脂吸附后皂苷質(zhì)量，g；Wl-供試液中皂苷質(zhì)量，g。
1.3.4大孔樹脂種類的選擇
分別選取X-5、AB-8、D-301、D-101、HPD-600、NKA-9、D-4020大孔樹脂純化川明參皂苷，在上樣液質(zhì)量濃度為0.4 g/mL、吸附流速為2 BV/h條件下，50%乙醇保持洗脫流速為4 BV/h進行洗脫，收集，減壓濃縮，冷凍干燥，得到川明參皂苷。以皂苷純度為指標，確定大孔樹脂的種類。
1.3.5川明參皂苷的大孔樹脂純化工藝優(yōu)化
根據(jù)單因素試驗，選取上樣液濃度、吸附流速、乙醇體積分數(shù)、洗脫流速四個因素的最優(yōu)試驗范圍，以皂苷純度作為優(yōu)化指標，采用正交試驗對川明參皂苷的的純化條件進行優(yōu)化。
1.3.6最小抑菌濃度(MIC)的測定
將川明參皂苷溶液和液體培養(yǎng)基配成質(zhì)量濃度分別為100, 50, 25，12.5，6.25，3.125和1.56 g/L液體，對照組設為空白。把25 VL菌懸液加進試管，經(jīng)過一段時間培養(yǎng)后，取出觀察，以濃度低而無肉眼可見菌生長的一管濃度為川明參皂苷對該菌的MIC。
1.3.7最小殺菌濃度(MBC)的測定
從1.3.6最小抑菌濃度(MIC)試驗結(jié)果為“一”的試管中，用微量移液器各移取0.3 mL于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，滅菌涂布棒推開，每一試管鋪3個平皿以設置重復試驗，之后在37℃下培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果。以培養(yǎng)基表面仍無細菌生長的最小藥物濃度為川明參皂苷對該菌的MBC。
2結(jié)果與分析
2.1大孔樹脂種類的選擇
大孔樹脂的吸附性能主要取決于吸附劑的表面性質(zhì)，即樹脂的極性功能基和空間結(jié)構、孔徑比表面積。由圖1可知，選擇Dl01大孔樹脂時，皂苷純度較高，比用其他大孔樹脂的效果好。
2.2川明參皂苷的大孔樹脂純化工
2.2.1上樣液濃度對川明參皂苷純化效果的影響
設定大孔樹脂純化川明參皂苷時，吸附流速為3 BV/h．乙醇體積分數(shù)為60010，洗脫流速為4 BV/h，分別在上樣液質(zhì)量濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2和1.4 g/mL七個梯度下，按1.3.2純化川明參皂苷并計算其純度。由圖2可知，當上樣液質(zhì)量濃度為0.6 g／mL，川明參皂苷純化效果較好。
2.2.2吸附流速對川明參皂苷純化效果的影響
設定大孔樹脂純化川明參皂苷時，上樣液質(zhì)量濃度為0.6 g/mL，乙醇體積分數(shù)為60%，洗脫流速為4BV/h，分別在吸附流速為1，2，3，4，5，6和7 BV/h六個梯度下，按1.3.2純化川明參皂苷并計算其純度。由圖3可知，當吸附流速為3 BV/h時，川明參皂苷純化
效果較好。
2.2.3 乙醇體積分數(shù)對川明參皂苷純化效果的影響
設定大孔樹脂純化川明參皂苷時，上樣液濃度為0.6 g/mL，吸附流速為3 BV/h，洗脫流速為4 BV/h，分別在乙醇體積分數(shù)為20%，300/0，40%．50%，60%，70%和80%七個梯度下，按1.3.2純化川明參皂苷并計算其純度。由圖4可知，當乙醇體積分數(shù)為60%時，川明參皂苷純化效果較好。
2.2.4洗脫流速對川明參皂苷純化效果的影響
設定大孔樹脂純化川明參皂苷時，上樣液質(zhì)量濃度為0.6 g/mL，吸附流速為3 BV/h，乙醇體積分數(shù)為60%，分別在洗脫流速為2，3，4，5，6，7和8 BV/h七個梯度下，按1.3.2純化川明參皂苷并計算其純度。由圖5可以看出，當洗脫流速為5 BV/h時，川明參皂苷純化效果較好。
2.2.5川明參皂苷的大孑L樹脂純化的優(yōu)化試驗
分別選取上樣液質(zhì)量濃度為0.4，0.6和0.8 g/mL，吸附流速為2，3和4 BV/h，乙醇體積分數(shù)為50%，60%和70%，洗脫流速為4，5和6 BV/h利用正交試驗優(yōu)化大孔樹脂純化川明參皂苷的最佳條件。因素水平見表1，結(jié)果見表2。
由表2可以看出，大孔樹脂純化川明參皂苷各因素的主次順序為A>B>D>C，即：上樣液濃度>吸附流速>洗脫流速>乙醇體積分數(shù)。大孔樹脂純化川明參皂苷的工藝條件最優(yōu)組合為A2B2C3D1，即：上樣液質(zhì)量濃度為0.6 g/mL，吸附流速為3 BV/h，乙醇體積分數(shù)為70%，洗脫流速為4 BV/h，此條件下大孔樹脂純化川明參皂苷純度為94.215%。
2．3川明參皂苷的抑菌性研究
2.3.1 川明參皂苷對供試菌的最小抑菌濃度(MIC)測定
川明參皂苷對供試菌的MIC測定結(jié)果見表3。從表中結(jié)果可以看出，川明參皂苷對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC為6.25%，對根霉和釀酒酵母的MIC為12.5%，對枯草芽孢桿菌和黑曲霉的MIC為25%。由此可知，川明參皂苷對供試菌有較強的抑制作用。
2.3.2川明參皂苷對供試菌的最小殺菌濃度(MBC)的測定
川明參皂苷對供試菌的MBC測定結(jié)果見表4。從表中結(jié)果可以看出，川明參皂苷對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和根霉的MBC為12.5%，對大腸桿菌和釀酒酵母的MBC為25%，對枯草芽孢桿菌和黑曲霉的MBC為50%。由此可知，川明參皂苷有較強的殺菌作用。
3結(jié)論
選用Dl01大孔樹脂純化川明參皂苷。川明參皂苷的大孔樹脂純化的最佳工藝條件，即上樣液質(zhì)量濃度為0.6 g/mL，吸附流速為3 BV/h，洗脫劑為體積分數(shù)70%乙醇，洗脫流速為4 BV/h，此條件下大孔樹脂純化川明參皂苷純度為94.21%。
川明參皂苷具有較好的抑菌活性，對細菌、霉菌和釀酒酵母都有很強的抑制效果。川明參皂苷對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC為6.25%，對根霉和釀酒酵母的MIC為12.5%，對枯草芽孢桿菌和黑曲霉的MIC為25%；對枯草芽孢桿菌和黑曲霉的MBC為50%。
4摘要
試驗主要研究了川明參皂苷的大孔樹脂純化工藝及其抑菌性。以皂苷純度為指標，選用D101大孔樹脂純化川明參皂苷。通過正交試驗確定川明參皂苷的大孔樹脂純化的最佳工藝條件，即上樣液質(zhì)量濃度為o．6 g/mL，吸附流速為3 BV/h，洗脫劑為體積分數(shù)為70%乙醇，洗脫流速為4 BV/h，此條件下大孔樹脂純化川明參皂苷純度為94.21%。川明參皂苷具有較強的抑茵活性。其中，對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC為6.25%，對根霉
和釀酒酵母的MIC為12.5%，對枯草芽孢桿菌和黑曲霉的MIC為25%;對枯草芽孢桿菌和黑曲霉的MIC為50%。
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