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     作者：田嘉                    

    冷鮮肉是指動(dòng)物屠宰后將衛(wèi)生檢驗(yàn)合格的胴體迅速冷卻到0℃~4℃，并在此溫度下對(duì)胴體進(jìn)行加工、貯運(yùn)和銷售的肉類，是歐美發(fā)達(dá)國家肉制品消費(fèi)的主要產(chǎn)品類型。我國是豬肉生產(chǎn)和消費(fèi)大國，其冷鮮產(chǎn)品在加工、流通、銷售等過程中存在的主要安全問題是微生物污染。已有研究表明，冷鮮豬肉表面的微生物主要包括嗜冷的革蘭氏陰性菌（如假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、熱死環(huán)絲菌屬、莫拉氏菌屬）及兼性厭氧的腸桿菌科。研究某品牌7種冷鮮豬肉產(chǎn)品的菌相組成，發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢(shì)腐敗菌均為假單胞菌。而Li等采用PCR凝膠電泳法分析冷鮮豬肉中微生物菌相組成也得到相同結(jié)論。保鮮劑處理是冷鮮肉制品常用的品質(zhì)維持技術(shù)，目前對(duì)于冷鮮豬肉中保鮮劑的評(píng)價(jià)篩選大多局限少數(shù)幾種。采用抑菌圈和生長曲線分析方法評(píng)價(jià)了60種化學(xué)保鮮劑對(duì)冷鮮豬肉中假單胞菌的抑制效果，確定有效的保鮮劑30種。在此基礎(chǔ)上，以電導(dǎo)率、堿性磷酸酶活力和菌體顯微形態(tài)為考察指標(biāo)，進(jìn)一步分析篩選出的30種保鮮劑對(duì)假單胞菌細(xì)胞膜的影響，旨在明確適用于冷鮮豬肉品質(zhì)維持的高效防腐保鮮劑。

1  材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

    試驗(yàn)菌株由實(shí)驗(yàn)室從冷鮮豬肉中分離培養(yǎng)，并經(jīng)中國典型培養(yǎng)物保藏中心鑒定為草莓假單胞菌。

    假單胞( CFC)選擇性培養(yǎng)基、PCA計(jì)數(shù)瓊脂，青島海博科技公司；酵母粉、蛋白粉，安琪酵母股份有限公司。

    無水乙醇、氯化鈉、丙酸、冰乙酸、抗壞血酸、檸檬酸、植酸、乳酸、甲酸、曲酸、苯甲酸、反T烯二酸、雙乙酸鈉、鞣酸、咖啡酸、乳酸鈉、肉桂酸、E-聚賴氨酸、海藻酸鈉、苯甲酸鈉、水楊酸、丙酸鈣、溶菌酶、氫氧化鈣、百里酚、茶多酚、殼聚糖、姜黃酮、肉桂油、酒石酸、對(duì)羥基苯甲酸乙酯：國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司。   

 MIR-154低溫恒溫培養(yǎng)箱：三洋國際；恒溫培養(yǎng)箱、鼓風(fēng)式干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；3100F/C電導(dǎo)率儀、掃描電子顯微鏡、電子分析天平：奧豪斯有限公司；恒溫震蕩培養(yǎng)箱：太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；低溫冷凍離心機(jī)：長沙平凡儀器儀表有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1假單胞菌屬菌懸液的制備

    將假單胞菌株在瓊脂培養(yǎng)基斜面上劃線培養(yǎng)，在30℃培養(yǎng)24 h后，取4~5個(gè)形態(tài)相同的菌落接種于液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)在30℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后于3 000 r/min離心10 min，棄上清液，將沉淀菌體用液體培養(yǎng)液稀釋至適宜濃度。

1.2.2假單胞菌的電導(dǎo)率測(cè)定

    取100 mL濃度為107 CFU/mL菌液于250 mL滅菌三角瓶中，加入終質(zhì)量濃度為1mg/mL保鮮劑（以不含保鮮劑的菌液作為對(duì)照組），置于28℃恒溫?fù)u床中在150 r/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)，分別在0，1，2，3，4，5和6h用電導(dǎo)率儀測(cè)定培養(yǎng)液的電導(dǎo)率。

1.2.3假單胞菌的堿性磷酸酶活力測(cè)定

    取100 mL濃度為109 CFU/mL的菌液于250 mL滅菌三角瓶中，加入終質(zhì)量濃度為1mg/mL的保鮮劑，使保鮮劑濃度固定在0.1 g/100 mL（以不含保鮮劑的菌液作為對(duì)照組），置于28℃恒溫?fù)u床中在150 r/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)，分別在0，1，2，3，4，5和6h取0.05 mL培養(yǎng)液，在3 500 r/min下離心10 min，采用堿性磷酸酶( AKP)試劑盒測(cè)定上清液中AKP活力。

1.2.4掃描電鏡觀察

    取100 mL濃度為109 CFU/mL的菌液于250 mL滅菌三角瓶中，加入終質(zhì)量濃度為1 mg/mL的保鮮劑（以不含保鮮劑的菌液作為對(duì)照組），置于28℃恒溫?fù)u床中在150 r/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)。24 h后取菌液5 mL，在4℃下以6 500 r/min轉(zhuǎn)速離心4 min，去除上清液。

用pH 7.0的0.1 mol/L磷酸緩沖液清洗沉淀菌體，用2.5%戊二醛固定20 h后棄上清液。固定菌體再次用磷酸緩沖液清洗3次，每次15 min。采用30%，50%，70%，90%及100%乙醇梯度脫水，每次5 min。采用醋酸異戊酯處理兩次脫除乙醇，每次5 min。將處理好的菌體樣品放于臨界點(diǎn)干燥，噴金后在掃描電子顯微鏡下拍照。

2結(jié)果與討論

2.1  保鮮劑對(duì)假單胞菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率的影響

    細(xì)胞膜受損造成細(xì)胞內(nèi)部電解質(zhì)外漏，從而使培養(yǎng)液的電導(dǎo)率上升，故可通過培養(yǎng)液中的電導(dǎo)率變化間接反映細(xì)胞膜的完整性。培養(yǎng)液中加入保鮮劑后，間隔1 h測(cè)定其電導(dǎo)率動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果如圖1所示。保鮮劑能明顯影響培養(yǎng)液中的電導(dǎo)率，如茶多酚試驗(yàn)組的電導(dǎo)率明顯高于空白對(duì)照組，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，電導(dǎo)率在2—4 h內(nèi)明顯增大，4h后趨于平緩，

同樣溶菌酶、乳酸鈉、丙酸、苯甲酸、植酸都能明顯引起培養(yǎng)液中電解質(zhì)含量增加，即能有效增大菌體的細(xì)胞通透性，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，起到抑菌作用。 研究不同濃度植酸對(duì)腐敗希瓦氏菌的抑菌機(jī)理中發(fā)現(xiàn)當(dāng)植酸濃度為1/2 MIC時(shí)，植酸未能使細(xì)菌破裂，反而由于植酸金屬離子的螯合作用和靜電作用導(dǎo)致培養(yǎng)液的電導(dǎo)率值偏小。

2.2保鮮劑對(duì)假單胞菌堿性磷酸酶活力的影響

    堿性磷酸酶存在于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間，當(dāng)細(xì)胞壁或細(xì)胞膜遭到破壞時(shí)，該酶會(huì)外漏至胞外，故可通過監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液中堿性磷酸酶活力反映細(xì)胞膜的通透性。培養(yǎng)液中加入保鮮劑后，間隔1h測(cè)定其堿性磷酸酶活力的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果如圖2所示。不同保鮮劑處理后培養(yǎng)液中的堿性磷酸酶活力變化趨勢(shì)有所差異。肉桂油、咖啡酸、溶菌酶、茶多酚、植酸等保鮮劑添加后，假單胞菌堿性磷酸酶活力都明顯升高。]測(cè)定添加茶多酚保鮮劑后假單胞菌的堿性磷酸酶含量，在4.5 h后菌液中堿性磷酸酶含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于空白組，與試驗(yàn)結(jié)果一致，表明茶多酚對(duì)假單胞菌細(xì)胞膜有較強(qiáng)的破壞能力。溶菌酶能水解細(xì)胞壁中的糖苷鍵，從而破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外漏，細(xì)胞死亡。

2.3保鮮劑對(duì)假單胞菌顯微形態(tài)的影響

    通過掃描電鏡觀察不同保鮮劑處理后假單胞菌顯微形態(tài)的變化（見圖3），電鏡圖片顯示空白對(duì)照組的菌體飽滿呈長柱狀、外部光滑且邊緣整齊。不同保鮮劑對(duì)假單胞菌的菌體顯微形態(tài)影響程度不同：甲酸、丙酸、冰乙酸、檸檬酸、E-聚賴氨酸、酒石酸或肉桂油處理后，培養(yǎng)液中未分離得到菌體，表現(xiàn)為對(duì)假單胞菌的致死作用；甲酸、曲酸、乳酸、姜黃

酮、百里酚、茶多酚、咖啡酸、殼聚糖、鞣酸、磷酸三鉀、肉桂酸或水楊酸處理后，假單胞菌菌體出現(xiàn)斷裂、缺口和畸形，表現(xiàn)為致菌體損傷；反丁烯二酸、抗壞血酸、植酸、乳酸鈉、雙乙酸鈉、乳酸鏈球菌素、丙酸鈣、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、水楊酸、海藻酸鈉、溶菌酶或氫氧化鈣處理后，假單胞菌菌體性狀不規(guī)則且表面粗糙，表現(xiàn)為致細(xì)胞膜損傷。如圖3所示，經(jīng)殼聚糖保鮮劑處理后，假單胞菌菌體出現(xiàn)彎曲變形，有些部位出現(xiàn)凹陷。研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖能使菌體細(xì)胞沉淀，影響細(xì)菌對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和細(xì)菌代謝物的排出，致使其生長代謝紊亂，從而達(dá)到抑菌作用。 觀察復(fù)合保鮮劑處理后腐敗希瓦氏菌的超顯微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌菌體表面出現(xiàn)泡狀物，可能是復(fù)合保鮮劑中的殼聚糖粘附在細(xì)菌表面，從而改變細(xì)胞壁和細(xì)胞膜性質(zhì)。

3結(jié)論

初步探討了保鮮劑對(duì)冷鮮豬肉中的優(yōu)勢(shì)菌屬假單胞菌屬的抑菌機(jī)理，從菌株的掃描電鏡照片、堿性磷酸酶含量、電導(dǎo)率變化三個(gè)指標(biāo)研究保鮮劑的抑菌機(jī)理。研究發(fā)現(xiàn)保鮮劑添加后對(duì)假單胞菌的形態(tài)、電導(dǎo)率、堿性磷酸酶含量均有影響，說明保鮮劑添加后能夠改變假單胞菌細(xì)胞膜的通透性、細(xì)胞壁的完整性，影響假單胞菌的形體、造成菌體內(nèi)環(huán)境紊亂，從而影響假單胞菌的生長代謝。以電導(dǎo)率、堿性磷酸酶活力和菌體顯微形態(tài)為考察指標(biāo)，研究30種保鮮劑對(duì)冷鮮豬肉中假單胞菌細(xì)胞膜的損傷作用。能顯著增加培養(yǎng)液的電導(dǎo)率。而能顯著增加培養(yǎng)液的堿性磷酸酶活力。采用掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)不同保鮮劑對(duì)假單胞菌顯微形態(tài)的影響主要可分為致死亡、菌體損傷和細(xì)胞膜損傷三類。研究說明茶多酚、植酸、溶菌酶、殼聚糖等保鮮劑均能有效破壞假單胞菌細(xì)胞膜的完整性，用于冷鮮豬肉防腐保鮮可產(chǎn)生較好的抑菌效果。

4摘要

研究多種保鮮劑對(duì)特定腐敗茵細(xì)胞膜的損傷作用，篩選出適用于冷鮮豬肉的高效防腐保鮮劑。分離培養(yǎng)冷鮮豬肉中假單胞菌，考察3()種保鮮劑對(duì)其培養(yǎng)液電導(dǎo)率和堿性磷酸酶活力的影響，發(fā)現(xiàn)茶多酚、溶菌酶、乳酸鈉、丙酸、苯酸鉀和植酸能顯著增加培養(yǎng)液的電導(dǎo)率，而肉桂油、咖啡酸、溶菌酶、茶多酚和植酸能顯著增加培養(yǎng)液的堿性磷酸酶活力。采用掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)不同保鮮劑對(duì)假單胞菌顯微形態(tài)的影響，其結(jié)果大致可分為致死亡、菌體損傷和細(xì)胞膜損傷三類。研究結(jié)果表明茶多酚、植酸、溶菌酶等保鮮劑均能有效破壞冷鮮豬肉中假單胞菌細(xì)胞膜的完整性，造成菌體內(nèi)環(huán)境紊亂，抑制其生長，預(yù)期產(chǎn)生良好防腐保鮮作用。