理論與實踐：超聲預(yù)處理酶解與常規(guī)酶解魚鱗膠原蛋白的比較
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在超聲波輔助酶促反應(yīng)過程中，一定條件下超聲波會對介質(zhì)產(chǎn)生機械、空化、化學(xué)和熱效應(yīng)作用，從而提高酶解的效果。近年來，不少學(xué)者和研究機構(gòu)致力于超聲波輔助提取動物膠原蛋白的研究，例如，胡建平應(yīng)用超聲波進行丁胃蛋白酶提取混合魚鱗膠原蛋白及其體外抗氧化作用的研究；楊萌萌等進行了超聲波輔助胃蛋白酶法提取青海牦牛牛蹄筋膠原蛋白的研究；殷涌光等口1進行了超聲波輔助枯草桿菌中性蛋白酶提取鹿皮膠原蛋白的研究；王林等進行了超聲波輔助胃蛋白酶提取深海紅魚魚皮膠原蛋白及其理化特性的研究；王希等進行了超聲波輔助提取鱈魚皮膠原蛋白的研究。上述文獻(xiàn)主要集中于超聲波輔助酶解工藝條件的優(yōu)化，而對各工藝參數(shù)對兩種酶解過程的影響未進行詳細(xì)的比較和分析。為了進一步深入探索和認(rèn)識超聲波在酶促反應(yīng)過程中的作用和機理，試驗采用木瓜蛋白酶提取草魚魚鱗膠原蛋白，重點研究超聲預(yù)處理酶解和常規(guī)酶解魚鱗膠原蛋白兩種過程在酶解溫度、pH、料液比值、酶解時間、酶濃度等工藝參數(shù)及動力學(xué)參數(shù)上的比較和分析，為超聲
波在酶解過程中的應(yīng)用提供理論參考。
1試驗
1.1材料及試劑
草魚魚鱗，收集于當(dāng)?shù)厥袌�，�?jīng)清洗晾干，冷凍保存；木瓜蛋白酶(1 000 U/mg)：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；甲醛、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉等均為國產(chǎn)分析純。
1.2儀器及設(shè)備
FA2104電子天平：上海雷韻實驗儀器制造有限公司；PHS-3E精密pH計：上海圣科儀器設(shè)備有限公司；KQ3200臺式超聲波清洗器：蘇州江東精密儀器有限公司；HH恒溫水浴鍋：江蘇金壇市中大儀器廠。
1.3試驗方法
1.3.1常規(guī)酶解
將脫鈣后的魚鱗置于錐形瓶中，加入木瓜蛋白酶溶液，在一定的恒溫條件下進行酶解反應(yīng)。反應(yīng)一定時間后取樣，測定水解度。
1.3.2超聲預(yù)處理時間
在超聲頻率20 kHz，超聲波功率150 W和pH 7.0、料液比值(魚鱗(g)／酶解液(mL))0.20 g/mL、溫度55℃、反應(yīng)時間2h的酶解條件下，考察超聲預(yù)處理時間5，10，15，20和25 min對草魚魚鱗水解度的影響，確定最佳超聲預(yù)處理時間。
1.3.3超聲預(yù)處理功率
在超聲頻率20 kHz，最佳超聲時間（由1.3.2節(jié)確定）和pH 7.0，料液比值0.20 g/mL．溫度55℃，反應(yīng)時間2h的酶解條件下，考察超聲波功率50，75，100，125和150 W對草魚魚鱗水解度的影響，確定最佳超聲波功率。
1.3.4 超聲預(yù)處理酶解
在超聲頻率20 kHz，最佳超聲時間和超聲波功率預(yù)處理的情況下，分別考察酶解溫度、酶解液pH、料液比值、酶解時間和酶濃度對水解度的影響，并與同樣條件下常規(guī)酶解結(jié)果進行比較分析。
1.3.5動力學(xué)研究
在超聲頻率20 kHz，最佳超聲時間和超聲波功率預(yù)處理的情況下，在底物質(zhì)量濃度分別為0.1，0.15，0.2, 0.25和0.3 g/mL的反應(yīng)體系進行酶解反應(yīng)，計算不同溫度和底物濃度下的酶解反應(yīng)速率。以底物濃度的倒數(shù)（1/[s]）作為橫坐標(biāo)，底物反應(yīng)速率的倒數(shù)
（1/(-rs)）作為縱坐標(biāo)，繪制Lineweaver-Burk圖，計
算米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速率( Vmax)值，并與同樣條件下常規(guī)酶解的結(jié)果進行比較分析。
1.3.6水解度(DH)測定
水解度( DH)測定采用電位滴定法。
2結(jié)果與分析
2.1 最佳超聲預(yù)處理時間的確定
根據(jù)1.3.2節(jié)操作，其結(jié)果如圖1所示。
由圖1可見，膠原纖維的水解度隨著超聲時間的延長呈先升高而后降低的趨勢，當(dāng)超聲時間為10 min耐，水餌度達(dá)到最大值，故確定最佳超聲預(yù)處理時間為10 min。
2.2最佳超聲波功率的確定
根據(jù)1.3.3節(jié)操作，其結(jié)果如圖2所示。
由圖2可見，膠原纖維的水解度隨著超聲波功率的增大呈單調(diào)升高趨勢，當(dāng)功率為150 W時，水解度達(dá)到最大值，因此確定最佳超聲波功率為150 W。
2.3超聲波預(yù)處理酶解與常規(guī)酶解的比較
2.3.1 酶解溫度
取超聲時間10 min和超聲波功率150 W，設(shè)定pH 7.0，料液比值0.2 g/mL，酶濃度2%，酶解時間6h，考察不同酶解溫度對超聲預(yù)處理酶解( Ultrasonic pretreatment enzymolysis, USPE)和常規(guī)酶解( Conventional enzymolysis，CE)水解度的影響并進行比較，結(jié)果見圖3。
從圖3可知，超聲預(yù)處理酶解和常規(guī)酶解的水解度均隨酶解溫度的升高而呈先增大后下降的趨勢，并分別在65℃和55℃獲得最大水解度，但在相同溫度下，前者的水解度均高于常規(guī)酶解，說明超聲預(yù)處理提高了酶催化的活性，這與Atequad等的研究結(jié)果是一致的。當(dāng)溫度較低時，由于超聲波頻率高，能量大，被介質(zhì)吸收時能產(chǎn)生顯著的熱效應(yīng)，從而加速酶解反應(yīng)，因此其水解度要高于常規(guī)水解。木瓜蛋白酶的最適溫度為55℃-65℃，試驗中，超聲預(yù)處理酶解的最適溫度( 65℃)高于常規(guī)酶解(55℃)，說明超聲作用可使木瓜蛋白酶能在較高的適宜溫度下獲得好的活性。超聲預(yù)處理酶解和常規(guī)酶解的水解度分別從65℃和55℃開始下降，但前者的下降幅度大于后者，這是由于當(dāng)酶解溫度過高時（超過適宜溫度的上限），一方面引起兩種過程中的酶蛋白變性，活性降低；另一方面超聲波的空化和化學(xué)效應(yīng)此時會對過程產(chǎn)生副作用，即引起亞基解聚合，產(chǎn)生自由基破壞酶分子構(gòu)象等，導(dǎo)致超聲波預(yù)處理酶解的水解度快速下降。
2.3.2 pH
取超聲時間10 min和超聲波功率150 W，設(shè)定料液比值0.2∥mL，酶濃度2%，酶解時間6 h，酶解溫度55℃，考察不同pH對超聲預(yù)處理酶解和常規(guī)酶解水觶度的影響并進行比較，結(jié)果見圖4。
由圖4可知，在相同pH下，超聲預(yù)處理酶解的水解度均高于常規(guī)酶解，且兩者的最適pH相同，表明超聲波不會改變生物酶（木瓜蛋白酶）的pH特性，該結(jié)果與Sakakibara等研究超聲波輔助蔗糖水解蔗糖的結(jié)果相似。pH對酶活性的影響是由于pH的改變會影響酶活性中心的必須基團的解離程度，同時還會影響底物的解離程度，從而影響酶分子對底物分子的結(jié)合和催化。只有在適合的pH范圍內(nèi)，才能使酶保持較高的活性。試驗中，超聲預(yù)處理酶解與常規(guī)酶解的最適pH相同，說明超聲預(yù)處理對木瓜蛋白酶活性基團和底物的解離影響不大�？紤]到操作環(huán)境的友好和后續(xù)產(chǎn)品純化的便利，試驗選定在中性環(huán)境( pH 7.0)下操作。
2.3.3料液比值
取超聲時間10 min和超聲波功率150 W，設(shè)定pH7.0，酶濃度2%，酶解時間6h，酶解溫度55℃，考察不同料液比值對超聲預(yù)處理酶解和常規(guī)酶解水解度的影響并進行比較，結(jié)果見圖5。
由圖5可知，常規(guī)酶解的水解度隨著料液比值的增大先提高而后降低，在料液比值0.2 g/mL時，達(dá)到最大值，隨后由于高料液比值引起的底物抑制作用，水解度開始下降。與之比較，超聲預(yù)處理酶解的水解度在相同的料液比值下均大于常規(guī)酶解，且在試驗范圍內(nèi)隨料液比值的增大而單調(diào)升高，其原因除了空化，化學(xué)和熱效應(yīng)外，還由于超聲波強烈的機械攪拌作用，分散了底物（膠原纖維）在魚鱗上的聚集，加速了底物與酶的質(zhì)量傳輸和酶促反應(yīng)，從而能在高料液比值下也能獲得較高的水解度。
2.3.4酶解時間
取超聲時間10 min和超聲波功率150 W，設(shè)定pH7.0，酶濃度20-/0，料液比值0.2 g/mL，酶解溫度55℃，考察不同酶解時間對超聲預(yù)處理酶解和常規(guī)酶解水解度的影響并進行比較，結(jié)果見圖6。
由圖6可知，超聲預(yù)處理酶解和常規(guī)酶解的水解度隨均反應(yīng)時間的增加而提高，且在相同時間下，前者高于后者。在超聲預(yù)處理酶解過程中，由于超聲波的機械，空化，化學(xué)和熱效應(yīng)的共同作用，加速了膠原纖維和木瓜蛋白酶分子的質(zhì)量傳遞，強化了反應(yīng)物之間的生化反應(yīng)，提高了水解效率，從而在獲得相同的水解度時，其所需時間少于常規(guī)酶解。當(dāng)超聲預(yù)處理酶解時間達(dá)到6h時，再增加時間對水解度影響不大，說明此時反應(yīng)已接近平衡。而常規(guī)醇解6h后，仍需要更多的時間才能使體系趨于平衡狀態(tài)。
2.3.5酶濃度
取超聲時間10 min和超聲波功率150 W，設(shè)定pH7.0，料液比值0.2 g/mL，酶解時間6h，酶解溫度55oC，考察不同酶濃度對超聲預(yù)處理酶解和常規(guī)酶解水解度的影響并進行比較，結(jié)果見圖7。
由圖7可知，超聲預(yù)處理酶解和常規(guī)酶解的水解度均隨酶濃度的增加而提高，且在相同酶濃度下，前者高于后者。與常規(guī)酶解比較，除了超聲波的機械，空化和熱效應(yīng)外，其化學(xué)效應(yīng)是加速膠原纖維水解的重要原因之一。由圖7可見，由于超聲的輔助作用，加快了酶促反應(yīng)，在酶濃度為2%時，超聲預(yù)處理酶解體系已趨于平衡，而常規(guī)酶解卻要在酶濃度3%時才能接近平衡，說明超聲預(yù)處理可補償用提高酶濃度加快反應(yīng)速率的作用效果。
2.3.6動力學(xué)參數(shù)
根據(jù)Michaelis和Menten的酶反應(yīng)機理和模型假設(shè)酶促動力學(xué)的Michaelis-Menten方程可寫成：
取超聲工作頻率20 kHz，輸出功率150 W，超聲預(yù)處理10 min，設(shè)定pH 7.0，酶濃度20-/0，按1.3.5節(jié)操作得不同溫度下的Vmax和Km，見表1。
由表1可知，不同溫度下，超聲預(yù)處理酶解的Vmax值均大于常規(guī)酶解的Vmax值，而Km值均小于常規(guī)酶解的K、值，這與許可等用超聲波研究對海芋過氧化物
酶催化活性影響的結(jié)果是一致的。米氏常數(shù)Km是酶的特征性常數(shù)，可以用來表示酶和底物親和力的大小，Km值越小，酶和底物的親和能力越強。KM與酶的結(jié)構(gòu)，底物和反應(yīng)環(huán)境有關(guān)，由于超聲波可能改變酶的結(jié)構(gòu)和環(huán)境，因此酶和底物的親和力增強，有利于提高水解度。Vmax是酶完全被底物飽和時的最大反應(yīng)速率，Vmax值越大，說明酶將底物轉(zhuǎn)為產(chǎn)物的效率越高。由于超聲波的“四效應(yīng)”作用，減弱了底物聚集，加速了底物和酶的質(zhì)量傳輸和相互接觸頻率，從而使其Vmax值在相同的操作條件下高于常規(guī)酶解。
3結(jié)論與討論
1)在相同的工藝條件下，脫鈣魚鱗經(jīng)超聲預(yù)處理后酶解，由于超聲波的機械，空化，化學(xué)和熱效應(yīng)作用，其水解度高于常規(guī)酶解。
2)將脫鈣魚鱗在20 kHz和150 W功率下超聲10 min后，于pH 7.0，料液比值0.2 g/mL，酶解溫度65℃和酶濃度2%下酶解6h，其水解度比相同條件下常規(guī)酶解提高8.14%。
3)與常規(guī)酶解比較，在一定的條件下，超聲預(yù)處理酶解可提高木瓜蛋白酶的最適宜活性溫度，在高料液比值下獲得較高的水解度，在較少的時間內(nèi)或在較低的酶濃度下使反應(yīng)體系趨于平衡狀態(tài)。
4)在不同的溫度下，超聲預(yù)處理酶解的動力學(xué)（米氏方程）參數(shù)Vmax和Km均分別大于和小于常規(guī)酶解，說明超聲預(yù)處理增強了酶與底物的親和力，提高了酶促反應(yīng)速率。
5)超聲預(yù)處理對木瓜蛋白酶活性基團和底物的解離影響不大，兩種酶解過程的水解度隨pH變化的趨勢基本相同，并在pH 4.0處獲得最大值�？紤]操作環(huán)境友好和產(chǎn)品后處理方便，建議在中性溶液中酶解。
6)在一定的超聲波功率范圍內(nèi)，超聲預(yù)處理酶解的水解度與超聲波功率成正比。由于試驗超聲設(shè)備的限制，最大功率為150 W，建議可在更高的功率下操作。
4摘 要
采用超聲預(yù)處理和常規(guī)方法分別進行了木瓜蛋白酶酶解草魚魚鱗膠原蛋白的研究。在超聲波頻率20 kHz,功率150W，超聲預(yù)處理時間10 min的條件下，從酶解溫度、料液比值、pH、酶解時間、酶濃度和動力學(xué)參數(shù)角度對兩種酶解過程進行了比較和分析。結(jié)果表明，在最佳工藝參數(shù)pH 7.0.料液比值0.2 g/mL、酶解溫度65℃和酶濃度20/6下酶解6h，超聲預(yù)處理酶解的水解度比常規(guī)酶解提高8.14%。在一定的條件下，超聲預(yù)處理酶解比常規(guī)酶解可提高木瓜蛋白酶的最適宜活性溫度，在高料液比值下獲得較高的水解度，在較少的時間內(nèi)或在較低的酶濃度下使反應(yīng)體系趨于平衡狀態(tài)，但對木瓜蛋白酶活性基團和底物的解離影響不大。在不同的溫度下，超聲預(yù)處理酶解的動力學(xué)常數(shù)Vm。，和特征參4?cK．。均分別大于和小于常規(guī)酶解，說明超聲預(yù)處理增強了酶與底物的親和力，提高了酶解的反應(yīng)效率。
