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作者：鄭曉敏

    苯丙氨酸解氨酶( Phenylalanine ammonia lyase，PAL．EC 4.3.1.24)是一種分子量在220—330 kDa，由4個(gè)亞基組成的酸性蛋白，是一種寡聚酶。廣泛存在植物和少量微生物中，是植物體內(nèi)苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，在微生物中可催化L-苯丙氨酸( L-Phenylalanine，L-phe)脫氨生成反式肉桂酸和氨。自1 96 1年Koukol和Corifl在植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并純化PAL后，對(duì)于這種酶的研究迅速展開(kāi)，是當(dāng)前生物化工領(lǐng)域研究與開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。在醫(yī)藥領(lǐng)域，純化后的PAL不僅可以治療某些腫瘤和苯丙酮尿癥患者，還可以生產(chǎn)低含量的苯丙氨酸食品。在生物化工方面，PAL是酶法生產(chǎn)L-phe的關(guān)鍵酶。但在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，PAL的活性易受到傳統(tǒng)催化介質(zhì)的影響，催化性能往往不能適應(yīng)生產(chǎn)條件，限制了PAL的應(yīng)用。

  離子液體( Ionic liquids，IL)又稱為室溫離子液體( Room temperature ionic liquid)、室溫熔融鹽( Room-temperature molten salts)等，是指由有機(jī)陽(yáng)離子和有機(jī)或無(wú)機(jī)陰離子構(gòu)成的在室溫或室溫附近( <100℃)呈液態(tài)的鹽類化合物。作為環(huán)境友好型“綠色溶劑”，除了具有蒸氣壓低、熔點(diǎn)低、溶解性好、穩(wěn)定性高、可循環(huán)利用等特性，還可以通過(guò)諼節(jié)陰陽(yáng)離子的配比來(lái)改變其極性、疏水性、密度、黏度及溶解性等物化性質(zhì)。因此，離子液體受到極大的關(guān)注，隨著研究的日益加深，被開(kāi)發(fā)和應(yīng)用到諸多領(lǐng)域，例如：有機(jī)反應(yīng)的介質(zhì)、催化、生物化學(xué)等，尤其是在生物催化方面被廣泛關(guān)注，目前主要應(yīng)用于木瓜蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、β一葡萄糖苷酶等酶催化反應(yīng)中，但在PAL酶催化應(yīng)用方面仍爹見(jiàn)報(bào)道。研究選用四種不同的離子液體[BMIMlPF_[BMIM]BF4、[HMIMlBF4和[HMIM]PF6作為催化介質(zhì)．研究了離子液體對(duì)PAL催化性能影響。為今后進(jìn)-步揭示離子液體對(duì)酶催化機(jī)理等相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)=

1  材料與方法

1.1材料與儀器

    膠紅酵母（Rhociotorula mucilaginosa）中國(guó)工業(yè)徽生物菌種保藏管理中心( CICC32913)；l一丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽、1一丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽、1一已基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽和1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（純度99%）：上海成捷化學(xué)有限公司；L-苯丙氨酸：北京百靈威科技有限公司；Sepharose 4B凝膠：北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；DEAE-sepharose FF凝膠：General Electric Company;其他試劑均為市售分析純。

    725型紫外分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；TGL-16C型離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；HC-3018型高速離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；VORTEX-5型渦旋振蕩器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；85-1B磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；核酸蛋白分離純化層析系統(tǒng)：上海青浦滬西儀器廠；ZHWY-211B回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜：上海智城分析儀器制造有限有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1  PAL的提取

    將培養(yǎng)好的膠紅酵母通過(guò)微珠渦流法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎并提取PAL的粗酶液。

1.2.2 PAL的部分純化

    通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀、Sepharose 4B凝膠層析和DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析技術(shù)對(duì)PAL進(jìn)行部分純化。

1.2.3酶活的測(cè)定方法

    酶活單位定義為每分鐘催化L-Phe生成1μmol反式肉桂酸所需酶量。并根據(jù)紫外分光光度法繪制反式肉桂酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此來(lái)計(jì)算PAL的酶活。

1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1反式肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

    分別配至1，3，5，7和9 mg/L的反式肉桂酸稀溶液，并在278 nm下測(cè)定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2離子液體的篩選

按表1和表2來(lái)配置5 mL的反應(yīng)體系，分別測(cè)定PAL在[BMIM]PF6、[BMIM]BF4、[HMIM]BF4和[HMIM]PF6四種離子液體中的酶活，確定最佳離子液體以及最適濃度。

1.3.3  最適反應(yīng)pH測(cè)定

    將2.75 mL離子液體，0.5 mL PAL和1 mL濃度為0.125 mol/L的L-phe放置試管中30℃下分別于6，7，8.8, 9.5和10的pH條件下進(jìn)行反應(yīng)10 min，并測(cè)定其酶活。

1.3.4最適反應(yīng)溫度測(cè)定

    將2.75 mL離子液體，0.5 mL PAL和1 mL濃度為0.125 mol/L的L-phe放置試管中緩沖液中于30℃，40oC, 50℃．60 oC和70℃條件下反應(yīng)10 min，并測(cè)定其酶活。

1.3.5溫度耐受性

    將2.75 mL離子液體，0.5 mL PAL用緩沖液補(bǔ)至體系總體積為4 mL，分別于50℃和60℃條件下進(jìn)行處理，每2h測(cè)定一次酶活。

1.3.6 pH耐受性

    將2.75 mL離子液體，0.5 mL PAL用緩沖液補(bǔ)至體系總體積為4 mL，分別于pH為4，6，8和10條件下處理2h，測(cè)定酶活。

1.3.7反應(yīng)表觀動(dòng)力學(xué)參數(shù)的確定

    將2.75 mL離子液體和0.5 mL PAL分別與0.34，0.4，0.5，0.66和1 mL濃度為0.125 mol/L的L-phe，用緩沖液補(bǔ)足到5 mL進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定酶活。

2結(jié)果與分析

2.1反式肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

采用1.3.1的方法，測(cè)定不同濃度反式肉桂酸在278 nm下的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，得線性方程y=17.684 8x-0.058 41，相關(guān)性R2=0.998 7。

2.2最佳離子液體的確定

以PAL在水相中的酶活為100%，加入不同比例的離子液體后PAL的活性見(jiàn)圖2，結(jié)果表明在離子液體加入后PAL的催化活性均有所變化。離子液體[BMIM]PF6、[BMIM]BF4和[HMIM]BF4的添加對(duì)PAL酶活有負(fù)面影響，隨著比例的增加，PAL活性均低于在水相中的活性（低于100%）。然而加入[HMIMlPF6后，PAL的活性明顯高于水相。且隨著離子液體濃度的增加PAL活性呈上升趨勢(shì)，最適濃度是50%左右。但[HMIM]PF6的加入量過(guò)高，對(duì)酶活反而產(chǎn)生不利的影響。這可能適當(dāng)[HMIMlPF6的加入影響了底物基團(tuán)的離子化狀態(tài)，或者改變了PAL的酶活結(jié)構(gòu)（構(gòu)象），影響其柔性結(jié)構(gòu)狀態(tài)，促使底物與酶的結(jié)合力增強(qiáng)，導(dǎo)致酶活上升。但當(dāng)[HMIMlPF6濃度過(guò)高時(shí)，體系的黏稠度增大，傳質(zhì)受阻，酶與底物的結(jié)合降低，酶活下降。

2.3  最適反應(yīng)pH確定

由圖3可見(jiàn)，測(cè)定了pH分別在6，7，8.8，9.5和10條件下的酶活力，發(fā)現(xiàn)當(dāng)PAL在單一緩沖體系時(shí)，緩沖液pH為8.8時(shí)，活力最高，大于或小于8.8，酶活力迅速降低，不利于反應(yīng)的進(jìn)行。加入一定量的[HMIMlPF6后，酶活最高點(diǎn)出現(xiàn)在了7，相比不加離子液體時(shí)pH向左偏移，而且在pH 7—10.5之間酶活下降比較平緩，酶活保留率均在60%以上。說(shuō)明離子液體的加入擴(kuò)寬了PAL的pH催化范圍。原因可能是在單一緩沖液中，過(guò)酸或過(guò)堿都會(huì)破壞酶的活性中心，使酶分子的構(gòu)象發(fā)生變化，不利于反應(yīng)的進(jìn)行。當(dāng)加入[HMIM]PF6后，離子液體的陰陽(yáng)離子保護(hù)了酶催化的pH微環(huán)境，使微環(huán)境pH緩沖能力提高，酶活性中心結(jié)構(gòu)得以保持，同時(shí)微環(huán)境中陰陽(yáng)離子的改變也會(huì)導(dǎo)致酶所攜帶官能團(tuán)的解離狀態(tài)發(fā)生變化，從而使催化反應(yīng)的pH范圍加寬。

2.4最適反應(yīng)溫度的確定

    研究了pH為7的條件下，PAL分別在30℃，40℃．50℃，60℃和70℃下的催化活性，結(jié)果見(jiàn)圖4，與最佳反應(yīng)溫度為50℃的單一緩沖液體系相比，加入一定量[HMIMlPF6后的最適反應(yīng)溫度為40℃，并且隨溫度的升高酶活力降低。可能由于隨溫度的增高，[HMIM]PF6的離子運(yùn)動(dòng)加快，阻礙了底物與酶的接觸，并且酶在高溫條件下容易變性，從而不利于反應(yīng)

的進(jìn)行。

2.5溫度耐受性

    將PAL分別于一定量[HMIM]PF6和單一緩沖液中在60℃條件下處理2，4，6，8和10 h，并測(cè)定其酶活。由圖5可以看出，在60℃處理?xiàng)l件下，PAL在含有[HMIM]PF6的兩相體系和只有水相的反應(yīng)體系中活性均有所下降都在下降，但在有離子液體的體系中PAL耐受高溫的能力要高于在水相中，在處理2h時(shí)，水相中的PAL基本失活，而在含有離子液體的兩相體

系中PAL尚能保留20%左右的酶活。

    將PAL分別在含一定量[HMIM]PF6的兩相體系和水相中在30℃，pH為4，6，8和10的條件下處理2h，測(cè)定其酶活。反應(yīng)結(jié)果如圖6，PAL在含有[HMIMlPF6的兩相體系中的對(duì)強(qiáng)酸堿的耐受性要高于水相，說(shuō)明加入離子液體的加入有助于提高PAL對(duì)酸堿的耐受能力，原因可能是[HMIMlPF6中的離子基團(tuán)在一定程度能阻礙酸、堿性環(huán)境中H+或OH-對(duì)酶活性中心的破壞，從而使酶穩(wěn)定性增強(qiáng)。

2.7反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km及最大反應(yīng)速度Vmax

    由于PAL催化反應(yīng)屬于單底物反應(yīng)，符合Michaelis -Menten方程。采用通過(guò)Lineweaver-Burk作圖法（又稱雙倒數(shù)作圖法）可推導(dǎo)出該反應(yīng)的米氏常數(shù)Km及最大反應(yīng)速度Vmax。

  l/v=Km/（Vmax.[Sl)+l/Vmax    (1)

  由l/v對(duì)1/[S]作圖，結(jié)果如圖7所示，2條直線的斜率為Km／Vmax，縱軸截距為l/Vmax，推導(dǎo)出該反應(yīng)的米氏常數(shù)Km及最大反應(yīng)速度Vmax表3所示。

由表3可以看出加入一定量[HMIM]PF6兩相體系中PAL的米氏常數(shù)Km比水相中的要低，而且最大反應(yīng)速率Vmax也要比單一緩沖體系高，而且，含有[HMIM]PF6兩相體系中PAL的Vmax／Km是水相體系中的15.2倍。這些結(jié)果表明，離子液體[HMIM]PF6的存在增強(qiáng)了PAL與底物的親和力，從而使酶活性提高。

3結(jié)論與討論

離子液體作為一種新型的介質(zhì)，在多種酶催化過(guò)程中被應(yīng)用，是當(dāng)前生物催化介質(zhì)工程研究的熱點(diǎn)之一，PAL被廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥、食品和生物化工領(lǐng)域，但和其他酶一樣存在活力低、穩(wěn)定性差的問(wèn)題，特別是傳統(tǒng)的催化介質(zhì)限制了PAL的應(yīng)用。試驗(yàn)研究了不同離子液體對(duì)PAL催化性能的影響，篩選出能顯著提高PAL催化活力的離子液體[HMIM]PF6，并考察了PAL在離子液體[HMIMlPF6的催化特性，結(jié)果表明，與水相相比，在反應(yīng)體系中加入55010的離子液體[HMIM]PF6，PAL酶活性被提高了33.5%。在含有離子液體[HMIMlPF6的兩相體系中PAL的最適pH和溫度發(fā)生變化，分別為7 oC和40 oC。同時(shí)發(fā)現(xiàn)離子液體[HMIM]PF6能改善PAL的熱穩(wěn)定性和pH耐受性。酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)證實(shí)離子液體[HMIMlPF6的添加提高了PAL與底物的親和力，導(dǎo)致酶活提高。此項(xiàng)研究將為今后探討離子液體中酶催化機(jī)制奠定基礎(chǔ)。4摘要  

研究了四種離子液體1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([BMIM]PF6)、1-T基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([BMIMlBF4)、1一已基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([HMIM]BF4)和1一己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([HMIM]PF6)對(duì)苯丙氨酸解氨酶(PAL)催化L-苯丙氨酸(L-phe)生成反式肉桂酸的影響，并考察了離子液體中PAL的部分催化性能。結(jié)果表明，添加55%的疏水性離子液體[HMIM]PF6能顯著提高PAL的催化活性，與對(duì)照相比，酶活提高了33.5%。加入[HMIMlPF6后，PAL最適催『匕pH、最適催化溫度分別是70C和40℃。同時(shí)發(fā)現(xiàn)耐受酸堿和熱穩(wěn)定性都有不同程度的提高，表觀動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vmax明，離子液體的添加能提高催化體系中酶與底物的親和力。