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作者：鄭曉敏

    以牛乳為原料生產(chǎn)的乳基嬰幼兒配方食品中蛋白組分的來(lái)源主要為牛乳的蛋白。牛乳中的蛋白質(zhì)可大致分為酪蛋白和乳清蛋白兩大類(lèi)，其中酪蛋白占乳蛋白的約80%，酪蛋白由αs1-酪蛋白（αs1-CN）、α一酪蛋白（αs2-CN）、β一酪蛋白（β-CN）和K-酪蛋白( K-CN)四種蛋白質(zhì)組成，且4種酪蛋白分別占總酪蛋白的40%，10%，40%和10%；乳清蛋白占乳蛋白的約20%，乳清蛋白主要由3-乳球蛋白（β-LG）、α一乳白蛋白（a-LA）、免疫球蛋白(Ig)和血清白蛋白( SA)組成，它們分別約占總?cè)榍宓鞍椎?00/0，20%，8%和5%。乳清蛋白和酪蛋白相比，乳清蛋白能為嬰兒提供更高的營(yíng)養(yǎng)，另外嬰兒的消化系統(tǒng)也更易消化乳清蛋白而非酪蛋白。成熟母乳中乳清蛋白和酪蛋白的比例為60：40。為了使嬰兒配方食品更接近母乳，為嬰兒提供更利于其生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)，我國(guó)市售的乳基嬰兒配方粉都通過(guò)添加乳清蛋白來(lái)調(diào)整乳粉內(nèi)乳清蛋白的含量。

    目前對(duì)于牛乳中蛋白含量的測(cè)定包括：凱氏定氮法、高相液相色譜法、雙縮脲法、分光光度法、四階導(dǎo)數(shù)分光光度法、凝膠電泳法、毛細(xì)管電泳法和氨基酸折算法等。而對(duì)于乳粉內(nèi)乳清蛋白含量的檢測(cè)，目前國(guó)內(nèi)主要依據(jù)GB/T 5413.2-1997，該法檢測(cè)時(shí)用光密度計(jì)來(lái)檢測(cè)不同蛋白的光密度，最后通過(guò)計(jì)算不同蛋白的光密度來(lái)計(jì)算乳清蛋白的含量。此法存在一定的缺陷，因?yàn)椴煌�的蛋白質(zhì)結(jié)合考馬斯亮藍(lán)的能力不同，相同濃度的不同蛋白就會(huì)表現(xiàn)出不同的光密度值，最后會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度較低，誤差較大。因此急需探尋一種更加準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單、成本低、且能適用于嬰幼兒食品這一復(fù)雜體系中乳清蛋白含量的檢測(cè)方法。

1  材料與方法

1.1材料與試劑

    標(biāo)準(zhǔn)品：α-酪蛋白、β-酪蛋白、K-酪蛋白、血清白蛋白、α-乳白蛋白和β一乳球蛋白，美國(guó)Sigma公司；丙烯酰胺( Acr)、Tris、N-N甲叉雙丙烯酰胺( Bis)、TEMED、十二烷基硫酸鈉(SDS)、過(guò)硫酸銨( Ap)、2×SDS-PAGE上樣緩沖液，上海迪申生物；冰醋酸、甲醇、甘油、考馬斯藍(lán)R-250，溴酚藍(lán)和甘氨酸等，國(guó)藥集團(tuán)。自配嬰兒配方粉，光明乳業(yè)中試車(chē)間；嬰兒配方粉，市售。

1.2儀器與設(shè)備

    Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳槽（美國(guó)Bio-Rad公司）；164-5050 Powerpac Basic電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；Gel DocrM XR+成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；脫色搖床TS-1000（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）；分析天平（梅特勒一托利多集團(tuán)）。

1.3方法

1.3.1  電泳分析方法

    利用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠分離乳粉內(nèi)的蛋白組分。

    分析條件：凝膠放置于裝有電泳液（電泳液pH為8.6．Tris 25 mmol/L，甘氨酸192 mmoIL，SDS1 g/L）的電泳槽內(nèi)進(jìn)行分析，先40 mA恒流電泳40 min，再把電流調(diào)為30 mA恒流電泳至藍(lán)色條帶距膠底部0.5 cm處止。然后移出電泳后的電泳膠，用0.1%的考馬斯亮藍(lán)染色液（冰醋酸75 mL，甲醇100 mL，考馬斯亮藍(lán)R-250 1 g，超存水825 mL配制成1 L染色液）染色約1.5 h。再用脫色液（冰醋酸75 mL，甲醇100 mL，超存水825 mL配制成1 L脫色液）脫色至背景透明。最后用成像儀拍照并用Quantity One圖像處理軟件計(jì)算。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)品及樣品處理方法

    酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合樣：α-酪蛋白、β-酪蛋白和k一酪蛋白以質(zhì)量比4:3:1配制成終蛋白質(zhì)量濃度為1.70 mg/mL的酪蛋白水溶液；乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合樣：β一乳球蛋白、α-乳白蛋白和血清白蛋白以質(zhì)量比8:3:1配制成終蛋白質(zhì)量濃度為1.43 mg/mL乳清蛋白水溶液。待檢樣品處理方式為：將待檢樣品溶解于超純水中，控制待檢樣溶液內(nèi)蛋白質(zhì)含量的終質(zhì)量濃度在2—4 mg/mL范圍內(nèi)。兩種混合標(biāo)準(zhǔn)蛋白水溶液和待檢樣溶液分別和2×SDS-PAGE上樣緩沖液等體積混合均勻，水浴煮沸3～5 min．然后迅速移入到冰水中冷卻，備于后續(xù)檢測(cè)。

1.3.3數(shù)據(jù)處理方法

    利用chemiDoc XRS+成像系統(tǒng)的Quantity One圖像處理軟件處理圖像，得出不同蛋白條帶總的trace值，然后以如下方法計(jì)算乳粉內(nèi)乳清蛋白占總蛋白的量。

    計(jì)算方法為：檢測(cè)樣內(nèi)6種蛋白質(zhì)( α-CN、β-CN、K-CN、SA、α-LA和β-LG)的trace值分別除以對(duì)應(yīng)的兩種混標(biāo)內(nèi)6種蛋白質(zhì)的trace值，再分別乘以每種標(biāo)準(zhǔn)蛋白的上樣量，計(jì)算出檢測(cè)樣內(nèi)6種蛋白的質(zhì)量。最后通過(guò)檢測(cè)樣內(nèi)3種乳清蛋白( SA、α-LA和β-LG)與6種蛋白質(zhì)（α-CN、β-CN、K-CN、SA、α-LA和β-LG）的比值計(jì)算得出乳清蛋白占總蛋白的百分比。

2結(jié)果與分析

2.1分離膠濃度的確定

不同濃度的分離膠進(jìn)行電泳試驗(yàn)的圖譜及圖譜條帶的trace值掃描圖見(jiàn)圖1和圖2。由圖l可知，10%和12%的分離膠濃度下電泳的條帶都有8條，15%的分離膠濃度下僅有7條。再對(duì)比10010的分離膠和12%的分離膠圖譜中條帶4和5可以發(fā)現(xiàn)，在分離膠12%的情況下乳粉樣的蛋白可以得到最大限度的分離。這一結(jié)論可以通過(guò)圖2的條帶trace值掃描圖得到進(jìn)一步的證實(shí)，10%的分離膠濃度下條帶4和5沒(méi)有在12%的濃度下分離效果好。因此，用于后續(xù)試驗(yàn)的分離膠濃度確定為12%。

2.2  電泳樣品上樣量及檢測(cè)方法的確定

如圖3所示為蛋白質(zhì)上樣量選擇的電泳圖譜及對(duì)應(yīng)的掃描圖，由圖3所示，蛋白質(zhì)上樣量為1.49和2.89μg時(shí)，圖譜的條帶清晰度不高，且在其掃描圖(圖3B)上響應(yīng)值明顯的條帶僅有6條。這說(shuō)明上樣量低，乳粉內(nèi)含量低的蛋白質(zhì)很難在SDS-PAGE凝膠上顯現(xiàn)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的上樣量達(dá)到10.12μg以上時(shí)，條帶5的分離效果不好，因此建議將乳粉內(nèi)蛋白質(zhì)的的上樣量控制在4.34—8.67 μg范圍內(nèi)。

圖4是標(biāo)準(zhǔn)蛋白與待檢樣蛋白的SDS-PAGE圖譜及對(duì)應(yīng)條帶trace值的掃描圖，是進(jìn)行樣品檢測(cè)時(shí)上樣方式和計(jì)算方式的示意圖。結(jié)合圖3及圖4可知嬰幼兒粉內(nèi)主要的蛋白質(zhì)有6種（α-CN、β-CN、K-CN、SA、α-LA和β-LG）。試驗(yàn)計(jì)算乳粉內(nèi)乳清蛋白占蛋白質(zhì)含量的計(jì)算方法是，首先得出樣品和標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)a-CN、3-CN、K-CN、SA、a-LA和3-LG這6種蛋白質(zhì)條帶總的trace值（利用Quantity One圖像處理軟件高斯建模后的trace值），再通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的上樣量計(jì)算所得（具體方法見(jiàn)1.3.3）。

2.3標(biāo)準(zhǔn)蛋白上樣量的確定

表1所示為兩種標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合樣不同上樣濃度檢測(cè)同一樣品乳清蛋白含量的結(jié)果。該結(jié)果顯示酪蛋白標(biāo)樣的上樣量從2.13—7.46 μg，乳清蛋白標(biāo)樣的上樣量從1.79—6.26 μg，檢測(cè)同一樣品，可以得到一致的結(jié)果。這一結(jié)果說(shuō)明在一定范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的上樣量大小不會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的差異，同時(shí)也說(shuō)明該檢測(cè)方法的可操作性高。但是，考慮到試驗(yàn)的經(jīng)濟(jì)型和結(jié)果的穩(wěn)定性，建議標(biāo)準(zhǔn)蛋白的上樣量為，酪蛋白混標(biāo)5μg左右，乳清蛋白混標(biāo)4 μg左右。

2.4不同乳清蛋白含量乳粉內(nèi)乳清蛋白含量的測(cè)定

    根據(jù)嬰兒配方粉生產(chǎn)工藝，實(shí)驗(yàn)室自行配制了乳清蛋白含量不同（乳清蛋白含量50%．55%，60010，65%．700/0和75%）的乳粉。然后用上述檢測(cè)條件對(duì)這些乳粉進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表2所示。該檢測(cè)結(jié)果所示，檢測(cè)值與理論值一致。且檢測(cè)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)

偏差( RSD)在1.85%—4.35%之間，說(shuō)明方法的重復(fù)性良好。

2.5市售乳粉內(nèi)乳清蛋白含量的測(cè)定

   研究隨機(jī)采集市售的乳基嬰兒配方粉12種，分別用SDS-PAGE電泳分析其乳清蛋白的含量。分析結(jié)果見(jiàn)表3，由該結(jié)果可見(jiàn)，所檢測(cè)的市售乳基嬰兒配方粉都能滿足我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 10765-2010“嬰兒配方食品”的規(guī)定，乳清蛋白的含量占總蛋白含量的60%以上。但是檢測(cè)結(jié)果也顯示，不同品牌的乳粉，其乳清蛋白占總蛋白的比例存在較大的差異，含量最低的僅為60.4%，剛剛滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T10765-2010的要求，含量較高的能達(dá)到70%左右。

3結(jié)果與討論

利用SDS-PAGE凝膠電泳分析乳粉內(nèi)乳清蛋白（α-乳白蛋白、乳鐵蛋白和β一乳球蛋白）的含量進(jìn)行半定量分析，可以得到理想的結(jié)果。試驗(yàn)建立的SDS-PAGE法測(cè)定乳基嬰兒配方食品內(nèi)乳清蛋白含量的操作條件為：濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度12%．40 mA恒流電泳40 min，再30 mA恒流電泳至電泳結(jié)束。依據(jù)嬰幼兒乳粉內(nèi)主要蛋白組分( α-CN、β-CN、K-CN、SA、α-LA和β-LG)來(lái)推算乳粉內(nèi)乳清蛋白占總蛋白的比例，上樣量為標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白混標(biāo)5μg左右，標(biāo)準(zhǔn)乳清蛋白混標(biāo)4μg左右，計(jì)算方法和標(biāo)品的上樣情況都得到了簡(jiǎn)化。建立的SDS-PAGE電泳分析方法，能夠做到對(duì)嬰幼兒乳粉內(nèi)的乳清蛋白進(jìn)行半定量分析，方法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，可以應(yīng)用于乳粉內(nèi)乳清蛋白含量的計(jì)算。 

4 摘要

采用SDS-PAGE對(duì)乳基嬰幼兒配方食品內(nèi)乳清蛋白進(jìn)行了分離和定量分析，優(yōu)化了試驗(yàn)條件，簡(jiǎn)化了數(shù)據(jù)的處理方法。結(jié)果表明采用該法對(duì)乳粉內(nèi)6種重要蛋白(α-酪蛋白、β-酪蛋白、K-酪蛋白、β一乳球蛋白、α-乳白蛋白和血清白蛋白)能實(shí)現(xiàn)較好地分離，依據(jù)乳清蛋白和酪蛋白的比值可以推算出乳清蛋白在乳粉內(nèi)的含量。對(duì)乳清蛋白含量不同的乳粉及市售嬰兒粉的測(cè)定表明，SDS-PAGE法是一種操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確快速測(cè)定乳粉內(nèi)乳清蛋白含量的方法。