經(jīng)驗介紹:GC- μECD法快速測定新疆馕制品丙烯酰胺
作者：張明
丙烯酰胺( Acrylamide，AM)作為國際公認的CMR 2A類致癌物質，具有潛在的神經(jīng)毒性、遺傳毒性和致癌性。2002年，瑞典NFA（國家食品管理局）公布了淀粉類食品經(jīng)高溫烹制后，會生成高含量丙烯酰胺。鑒于丙烯酰胺對人體的危害，我國衛(wèi)生部于2005年發(fā)布了《食品中丙烯酰胺的危險性評估》的報告，以減少因丙烯酰胺可能導致的健康危害。
“馕”作為新疆傳統(tǒng)食品的代表，已有2 000多年的歷史。馕制品在新疆人民膳食結構中占有非常大比例，其配料及馕坑特殊的高溫烤制具備了丙烯酰胺產(chǎn)生的條件，這意味著消費者在持續(xù)不斷地攝人丙烯酰胺。目前，我國關于馕制品中丙烯酰胺的相關研究甚少，而食品中痕量丙烯酰胺的測定方法主要有英國科學試驗中心Castle報道的GC-MS法，美國FDA公布的LC-MS法和Paleologos和Kontominas等采用的HPLC法。其中GC-MS法和LC-MS法對技術和設備的要求很高，方法普及難度較大；而HPLC法的樣品凈化繁瑣，試劑純化要求高。因此，建立馕制品中丙烯酰胺的檢測方法對于監(jiān)測和安全評價新疆各民族人民的健康飲食，以及能否實現(xiàn)新疆民族傳統(tǒng)食品的健康發(fā)展具有重要意義。試驗以新疆馕制品為研究對象，采用電子俘獲檢測器（μECD），建立了GC- μECD快速測定馕制品中丙烯酰胺的方法。該方法樣品前處理簡單，具有快速、廉價、準確的特點，便于方法普及.
1 材料與方法
1.1材料與儀器
市售馕制品。
丙烯酰胺( AM)：純度>99.9，上海富眾生物科學有限公司；2，3-二溴丙酰胺標準品(2．
3-DBPA)：純度>99.8，上海晶純生化科技股份有限公司；正己烷、乙酸乙酯：分析純，霍尼韋爾貿易有限公司；亞鐵氰化鉀：分析純，天津市化學試劑三廠；硫酸鋅、溴：分析純，天津市福晨化學試劑廠；無水硫酸鈉：分析純，天津市致遠化學試劑有限公司；冰乙酸、溴化鉀：分析純，天津市光復科技發(fā)展有限公司；氫溴酸：分析純，天津市天大化工實驗廠；硫代硫酸鈉：分析純，天津永晨精細化工有限公司；蒸餾水（二次蒸餾）。
Agilent 6890N氣相色譜儀：美國Agilent公司；電子俘獲檢測器（μECD）；Agilent 19091J-413毛細管色譜柱（30 m×320斗m×0.25 pm）：美國Agilent公司；N-1001旋轉蒸發(fā)儀：鄭州科工貿有限公司；TGL-16gR高速冷凍離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司；FW-100高速萬能粉碎機：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。
1.2試驗方法
1.2.1溶液的配制
丙烯酰胺標準液：精確稱取5.00 mg丙烯酰胺標準品溶解于5 mL蒸餾水中，得1 mg/mL的丙烯酰胺的儲備液，再將其稀釋為10 μg/mL的標準溶液，至于40C冰箱密封保存（丙烯酰胺物質在常溫下化學性質極其穩(wěn)定，不易發(fā)生變化，但考慮到試驗準確性，試劑最好現(xiàn)用現(xiàn)配，且密封保存）。
2. 3-DBPA標準溶液的配制：溶解2，3-DBPA于乙酸乙酯中得1mg/mL的儲備液，再將儲備液稀釋為10μg/mL的標準溶液，至于4℃冰箱待用。
Carrez I試劑：稱取14.4 g亞鐵氰化鉀溶于50 mL水中。
C arrezⅡ試劑：稱取28.8 g硫酸鋅溶于50 mL水中。
飽和溴水：將約4 mL溴加入250 mL水中至沉淀出現(xiàn)。
1.2.2樣品前處理
來源：自烏魯木齊市場上購買的馕制品作為樣品。
提�。衡沃破逢幐煞鄞夂螅瑴蚀_稱取5.00 g馕粉樣品于100 mL錐形瓶中，加提取溶劑蒸餾水50 mL，50℃水浴均質40 min，并經(jīng)常搖動。向懸浮液中加入約0.5 mL冰醋酸酸化至pH 4～5，加入Carrez I試劑和CarrezⅡ試劑各2 mL處理，充分搖勻后靜置5 min，于8 000×g下離心15 min。上清液過濾至100 mL錐形瓶中。
柱前溴化衍生：稱取煅燒過的KBr 5 g溶解于濾液中，加氫溴酸調節(jié)pH 1—3后再加10 mL飽和溴水于錐形瓶中，不斷攪拌，并用鋁箔密封后轉移至冰浴反應3 h。
蒸發(fā)：待反應完成后，加入幾滴1 mol/L Na2S203，終點為黃色消失，使得過量的溴分解。再將混合物移人一個250 mL分離漏斗中用50 mL乙酸乙酯／正已烷（4:1，V/V）抽提，搖動60 s。相分離后，丟棄較低的水層。有機相經(jīng)脫水（經(jīng)煅燒Na2S04 15 g）過濾到100 mL圓底燒瓶內�；旌橡s分用旋轉蒸發(fā)儀(55℃，真空)蒸發(fā)后定容至5 mL用于GC分析。
1.2.3氣相色譜條件
程序控制分流／不分流進樣器( PSS)；Agilent19091J-413毛細管色譜柱(30 m×320 μm×0.25μm)；載氣N2，流速1.6 mL/min；不分流進樣；進樣方式：自動進樣；進樣量1 μL，進樣口溫度260℃，檢測器溫度375℃；程序升溫：65℃(1 min，15 oC/min) →120 ℃(40 ℃/min)→170℃(15℃/min)~240℃(10 min)。
1.2.4標準曲線的繪制
向6個含有100 mL蒸餾水的250 mL錐形燒瓶中分別加入0，2，4，6，8和10 μL的丙烯酰胺標準溶液，然后再將這些溶液按照1.2.2進行樣品前處理，定容后取樣液進行GC分析。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。
1.2.5樣品定量分析
根據(jù)標準曲線定量分析計算2，3-=溴丙酰胺含量，換算得到馕制品中丙烯酰胺的含量，換算公式為：
Y=CV/W (1)
式中：Y-樣品中丙烯酰胺含量，μg/kg; C-由準曲線得到的提取液中2，3-=溴丙酰胺的質量濃度，μg/mL; V-樣品提取液定容的體積，mL；W-稱取的樣品的質量，kg。
2結果與分析
2.1定性試驗
分別取乙酸乙酯、2，3-DBPA標準溶液(10 μg/mL)和樣品提取液進樣，比較三者色譜圖，確定2，3-DBPA的保留時間為5.453 min。
2.2標準曲線繪制
以2，3-DBPA質量濃度為橫坐標，其峰面積為縱坐標作標準曲線，得線性回歸方程：y=1 490.5x+27.714．R2=0.998 8。結果表明：在0.2—1.0μg/mL的質量濃度范圍內線性相關性良好。
2.3馕制品中丙烯酰胺浸提溶劑選擇
比較蒸餾水、甲醇和乙腈三種試劑對馕制品中丙烯酰胺的提取效果。研究發(fā)現(xiàn)蒸餾水、甲醇和乙腈的浸提效果都較好，峰形和對稱性良好，但乙腈在GC上的分離效果較甲醇差，存在拖峰現(xiàn)象。丙烯酰胺是一種強極性化合物，在水中的溶解度最大，對于大多數(shù)食品樣品提取完全，再者從經(jīng)濟和安全的角度綜合考慮，選擇蒸餾水作為浸提溶劑較為合適。
2.4馕制品中丙烯酰胺浸提時間的確定
稱取馕樣品5份，每份5.00 g，以蒸餾水為浸提溶劑，于55℃下分別浸提20，30，40，50和60 min，比較不同浸提時間對樣品中丙烯酰胺的提取效果，以確定最佳浸提時間，結果見圖3。
由圖3可以看出隨著浸提時間的延長，樣品中丙烯酰胺的提取率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當浸提時間為40 min時提取率最大，隨著時間延長，樣品液出現(xiàn)糊化現(xiàn)象，可能影響浸提效果。因此選擇時間40 min作為馕制品中丙烯酰胺的浸提時間。
2.5馕制品中丙烯酰胺浸提溫度的確定
稱取馕樣品5份，每份5.00 g，以蒸餾水為浸提溶劑，分別于40℃，50℃，60℃．70℃和80℃下浸提40 min，比較不同浸提溫度對丙烯酰胺的提取效果，以確定最佳浸提溫度．結果見圖4。
由圖4可以看出隨著浸提溫度的升高，樣品中丙烯酰胺的提取率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。浸提溫度為50℃時提取率最大，隨著溫度繼續(xù)升高，糊化程度嚴重，樣品液流動性降低，從而使浸提效果降低。因此選擇溫度50℃作為馕制品中丙烯酰胺的浸提溫度。
2.6精密度及檢出限
精密度是指在相同條件下多次重復測定結果之間相符合的程度。試驗分別對不同質量濃度(1，1.5，2和3μg/mL）的標準品進行6次平行測定，結果見表l。精密度試驗RSD為3.211%，GC-μECD方法精密度較好。
方法的檢出限( LOD)定義為產(chǎn)生3倍信噪比( S/N=3)的化合物的質量濃度，選取較低濃度的2，3-DBPA標準溶液，在最佳氣相色譜條件下平行測定6次，信噪比S/N=3時2，3-DBPA的檢出限為0.023μg/kg。
方法的定量限( LOQ)定義為產(chǎn)生10倍信噪比( S/N=10)的化合物的質量濃度，選取較低濃度的2. 3-DBPA標準溶液，在最佳氣相色譜條件下平行測定6次，信噪比S/N=10時2，3-DBPA的檢出限為0.077μg/kg。
2.7重復性試驗
稱取馕樣品3份，每份5.00 g，精密吸取樣品處理液1μL，在檢測色譜條件下測定5次，計算含量平均值及RSD，結果見表2。重復性試驗的RSD為2.337%；GC- μECD方法重復性良好。
2.8方法的回收率試驗
稱取馕樣品5份，每份5.00 g，分別添加不同質量濃度（0.4，0.8，1.2，1.6和2.0 μg/mL）的標準品并以1.2.2的方法進行處理，每個水平重復3次，進行GC分析，計算分析各組分的加標回收率，結果見表3。結果顯示平均回收率在75.81%±3.51%，RSD為2.506%，表明GC-μECD檢測馕制品中的丙烯酰胺具有良好的回收率，方法可行�？捎糜阝沃破分斜０返臋z測。
3結論
丙烯酰胺化學性質不穩(wěn)定，當溫度達到其熔點時易聚合成聚丙烯酰胺，與溴加成反應生成的溴化產(chǎn)物2，3--溴丙酰胺熱穩(wěn)定性良好，且ECD對其具有較好的響應。試驗建立的新疆馕制品中痕量丙烯酰胺的GC- μECD測定法，以蒸餾水做為提取劑，Carrez I和CarrezⅡ沉淀蛋白去除油脂，采用μECD測定丙烯酰胺的含量。結果表明，丙烯酰胺在0.2~1.0μg/mL質量濃度范圍內，線性關系良好，相關系數(shù)R2=0.998 8．檢出限0.023μg/kg，定量限0.077μg/kg，平均回收率為75.810/0±3.51%，精密度相對標準偏差(RSD)為2.987%，重復性相對標準偏差(RSD)為2.337%�？梢�，該方法檢測靈敏度高，定量準確性高。試驗利用已建立的方法對新疆其他民族特色烘烤油炸食品巴哈利，馓子等的丙烯酰胺進行了分析測定，檢測效果良好。因此，該方法適用實驗室常規(guī)食品中痕量丙烯酰胺含量的檢測，具有一定實用性和推廣價值。
4摘要
以新疆特色傳統(tǒng)食品馕為研究對象，建立馕制品丙烯酰胺的GC-μECD檢測方法。樣品經(jīng)提取、凈化、溴化和濃縮后進行氣相色譜分析。試驗采用電子俘獲檢測器測定丙烯酰胺的含量。結果表明，在o．2~1．o μg/mL-量濃度范圍內，方法的線性關系良好，相關系數(shù)R2=0.998 8，檢出限0.023 μg/kg，平均回收率為75.81%±3.51%，精密度相對標準偏差(RSD)為2.987%，重復性相對標準偏差(RSD)為2.337%。該方法操作簡便，靈敏度高，適用于馕制品中丙烯酰胺的測定。
