檢測梨汁中外源性有機(jī)酸摻偽的最新方法
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作者：田嘉
有機(jī)酸是果汁中主要的風(fēng)味營養(yǎng)物質(zhì)，其含量高低與果汁制品的品質(zhì)有著密切關(guān)系。此外，果汁中的有機(jī)酸還可促進(jìn)消化腺的活動(dòng)，改善患者的食欲，有助于食物的吸收。天然果汁營養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者青睞。然而，由于水果原料和生產(chǎn)成本的限制，果汁的摻假現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，一些商家為了追求利潤，通常向少量原果汁中加入一些檸檬酸等酸味調(diào)節(jié)劑而勾兌成果汁，或者將香精、色素、防腐劑、甜味劑和檸檬酸等添加劑勾兌在一起，以次充好，以假亂真，造成了市場的混亂。因此果汁摻偽檢測成為國內(nèi)外關(guān)注的焦點(diǎn)。
我國梨的優(yōu)質(zhì)果率較低，削弱了梨果的市場競爭力，且大多數(shù)品種梨的貯藏性能有限，因此除一部分鮮食外，及時(shí)的將梨進(jìn)行加工制汁，既能滿足廣大消費(fèi)者的需求又可以解決鮮梨的銷售問題。梨汁中主要存在的有機(jī)酸有：蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、酒石酸、莽草酸、奎寧酸、富馬酸、乳酸等，其中蘋果酸和檸檬酸為主要有機(jī)酸，而果汁摻偽中的重要成分
亦為檸檬酸和蘋果酸。另外，由于梨果中的蘋果酸主要為L-蘋果酸，通常不含D-蘋果酸，即使有含量也非常小，因此，通過測定梨汁中檸檬酸和L-蘋果酸的含量及相互比例，可以鑒別梨汁的摻假現(xiàn)象。如果檸檬酸含量超過一定比例或有D-蘋果酸存在，即可判定該梨汁中添加有外源性檸檬酸或DL型蘋果酸。
有機(jī)酸含量的測定方法主要有：化學(xué)滴定法、熒光法、比色法、氣相色譜法、薄層色譜法等方法�；瘜W(xué)滴定法一般只用于測定食品中的總酸度；后面幾種方法雖然可以檢測單個(gè)的有機(jī)酸的含量，但是樣品前處理較繁瑣。高效液相色譜法( HPLC)具有簡便、迅速、靈敏度高、重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)，是目前主要方法。試驗(yàn)通過選取不同地區(qū)不同品種的梨果加工成梨汁后，以反相高效液相色譜法測定該梨汁中檸檬酸和蘋果酸的含量，以檸檬酸和L-蘋果酸含量之比作為判斷梨汁中是否添加檸檬酸的依據(jù)；以是否有D-蘋果酸作為判斷梨汁中是否添加DL型蘋果酸的依據(jù)。
1 材料與方法
1.1材料與試劑
不同品種的梨果在0℃下貯藏20 d，未受到其他污染物的污染，品質(zhì)良好。梨汁樣品：市售。
檸檬酸、L-蘋果酸和D-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)品：河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院提供，純度大于99.0%；甲醇（色譜純）、磷酸二氫鉀、磷酸（分析純）：天津康科德科技有限公司；試驗(yàn)用水均為超純水；0.45 μm有機(jī)相微孔濾膜：天津市沃爾孚科技發(fā)展有限公司。
1.2儀器與設(shè)備
LC-20A高效液相色譜儀（配有SPD-20A型紫外檢測器和LC solution工作站）：日本島津公司；AL204萬分之一電子天平：梅特勒一托利多有限公司；TG18G高速離心機(jī)；鹽城市凱特儀器有限公司；KUDOS-SK5200LHC超聲波清洗器：上�？茖�(dǎo)超聲儀器有限公司；PTD-20-3超純水制備儀：上海力新儀器有限公司；PB-10型pH計(jì)：德國賽多利斯。
1.3試驗(yàn)方法
1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
用電子天平分別精確稱取400 mg的檸檬酸、L-蘋果酸和D-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)品用超純水溶解并定容至100 mL的容量瓶中。將上述溶液配置成不同濃度的混標(biāo)，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，各取20 μL上色譜儀進(jìn)樣分析。以標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，獲得檸檬酸、L-蘋果酸和D-蘋果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)。
1.3.2樣品前處理
適時(shí)采收不同品種的梨果，在0 oC下貯藏20—30 d后，按以下工藝流程制成梨原汁，冷凍保存待分析測定。
原料→破碎→榨汁→離心→澄清斗過濾→原汁→冷凍貯藏
將待測樣品用超純水稀釋5倍，經(jīng)0.45 ym微孔濾膜過濾后測定，供HPLC分析，每個(gè)樣品重復(fù)測定3次，取其平均值。
1.3.3液相色譜條件
色譜主為GREEN ODS-AQC18柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇和0.01 mol/L磷酸二氫鉀（體積比為3：97，pH 2.9用磷酸調(diào)配），檢測波長為210nm．流速0.5 Ml/min;柱溫30℃，進(jìn)樣量20μL。
1.3.4梨汁樣品中檸檬酸和蘋果酸含量的測定
對(duì)梨汁樣品平行測定5次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，對(duì)試樣中的檸檬酸和蘋果酸的含量進(jìn)行定性和定量分析。
2結(jié)果與分析
2.1檢測方法的確定
2.1.1色譜分離條件的確定
在有機(jī)酸的測定方面，常用檢測波長為210 nm常用色譜柱為C18柱，流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖體系。由于純磷酸鹽流動(dòng)相會(huì)增加對(duì)色譜柱的損壞程度，為了使有機(jī)酸得到更好的分離效果，試驗(yàn)比較了Agilent Eclipse XDB-C18( 4.6 mm×150 mm,5μm),Welch Vltimate XB-C18( 4.6 mm×250 mm,5μm)和BOSTON GREEN ODS-AQ Cla（4.6 mm×250 mm，5斗m）不同的C18柱、不同配比的甲醇一磷酸鹽溶液、流動(dòng)相pH、流速以及柱溫等因素對(duì)有機(jī)酸分離的影響，最終得到的色譜分離條件如下：色譜柱，BOSTON GREEN ODS-AQ C18柱(4.6 mmx 250 mm,5μm)；流速，0.5 mL/min；流動(dòng)相，甲醇和磷酸二氫鉀(體積比為3：97，pH 2.9)；柱溫，30℃。圖1為該條件下測定的檸檬酸和蘋果酸的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖，圖2為純梨汁色譜圖。
2.1.2混合標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限
將配制好的質(zhì)量濃度分別為0.02, 0.05，0.10．0.50，1.00，2.00和4.00 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液液，按2.3.3的色譜條件進(jìn)行HPLC分析，平行測定3次。以峰面積(Y)對(duì)質(zhì)量濃度X(mg/L)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程及相關(guān)系數(shù)。根據(jù)十倍噪音的峰面積響應(yīng)值和方法回收率，得到檸檬酸和蘋果酸的最低檢出限。測定表明，檸檬酸的檢出限為0.3μg/mL，L-蘋果酸的檢出限為0.2 μg/mL，D-蘋果酸的檢出限為0.5μg/mL。檸檬酸和蘋果酸的回歸方程，相關(guān)系數(shù)和最低檢出限如表1所示。
2.1.3方法回收率及精密度的測定
試驗(yàn)分別取1.0 mL的同一梨汁四份稀釋5倍后，其中一份作空白樣品（梨汁樣品的色譜圖如圖2所示），另三份分別添加一定量的檸檬酸，L-蘋果酸和D-蘋果酸，檸檬酸的添加水平分別是0.2和0.8 mg/mL，L-蘋果酸的添加水平分別是0.5和1.5 mg/mL，D-蘋果酸的添加水平分別是0.01和0.02 mg/mL。按照前述檢測條件分別測定各成分含量，每份樣品進(jìn)行6次平行檢測，考察方法的回收率和精密度。測得的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差如表2所示。結(jié)果表明，梨汁樣品在3個(gè)添加水平下，樣品中檸檬酸和L-蘋果酸的回收率在91.7%—101.9%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.12%—1.55%之間，說明該方法準(zhǔn)確度和精密度良好，能夠滿足樣品測試的要求。
2.2不同品種梨汁中檸檬酸和蘋果酸的含量和比例
按上述色譜條件，對(duì)不同產(chǎn)地及品種梨汁中的檸檬酸和L-蘋果酸進(jìn)行測定，每種檢測4次求得其平均值，結(jié)果如表3所示。由于D-蘋果酸在測定過程中的含量幾乎為零，因此表3中不再列出。
由表3可知，河北產(chǎn)地的鴨梨和雪花梨中檸檬酸的含量分別為1.13和0.29 mg/mL，蘋果酸的含量分別為1.96和1.86 mg/mL．檸檬酸和蘋果酸的比例分別為57.7%和15.6%；天津產(chǎn)地的鴨梨和雪花梨中檸檬酸的含量分別為1.11和0.26 mg/mL，蘋果酸的含量分別為1.74和1.81 mg/mL，檸檬酸和蘋果酸的比例分別為63.8%和14.4%。對(duì)于同一品種的純梨汁，產(chǎn)地對(duì)檸檬酸和L-蘋果酸的比例影響相對(duì)較小。但是在不同品種間差別較大，其比例范圍在5.82%—64.2%之間，其中以新疆產(chǎn)的大果水晶梨中檸檬酸和L-蘋果酸的比例最高，但其比均小于100%，即所有純梨汁中檸檬酸的含量均小于L-蘋果酸的含量.由此可以推斷，當(dāng)某一品種梨汁中檸檬酸和和L-蘋果酸的比例出現(xiàn)劇烈變化，其比值超過l時(shí)，即可判斷此果汁中添加了外源有機(jī)酸——檸檬酸；檢測中若有D-蘋果酸的色譜峰，則可推斷果汁中添加了外源有機(jī)酸-DL-蘋果酸。
2.3市場梨汁中檸檬酸和蘋果酸含量測定
由圖1可知，蘋果酸的保留時(shí)間在8.4 min左右，檸檬酸的保留時(shí)間在14.6 min左右。圖3同圖l相對(duì)照可知，梨汁樣品中含有檸檬酸和L-蘋果酸。根據(jù)表1的相關(guān)方程，通過外標(biāo)法計(jì)算得出梨樣品1中檸檬酸和L-蘋果酸的含量分別為2.968和0.045 mg/L，兩者的比例為6 595.6%;梨樣品2中檸檬酸和L-蘋果酸的含量分別為1.303和0.214 mg/L，兩者的比例為608.9%，與表3相比比例大大超出了正常果汁的比例范圍，這表明這兩種梨汁樣品中均添加了外源有機(jī)酸——檸檬酸。
3結(jié)論
1)利用HPLC法在BOSTON GREEN ODS-AQ C18柱色譜柱上，以體積分?jǐn)?shù)3%的甲醇和0.01 mol/L的磷酸二氫鉀( pH 2.9)為流動(dòng)相，可將果汁中的檸檬酸，L-蘋果酸和D-蘋果酸進(jìn)行較好地分離。該方法操作簡單，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.120/0—1.55%，回收率為91.7%—101.9%．兩種酸的線性相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999。
2)梨汁中以檸檬酸和L-蘋果酸為主，這兩種有機(jī)酸的含量在不同品種間差別較大，而在同一品種不同產(chǎn)地梨汁中差別較小，但其含量之比均小于100%，根據(jù)此比例關(guān)系可確定果汁中是否添加有外源有機(jī)酸——檸檬酸。
由于當(dāng)前果汁摻偽問題主要是單獨(dú)添加檸檬酸，因此，當(dāng)梨汁中添加少量的檸檬酸后即會(huì)急劇改變梨汁中檸檬酸和蘋果酸的比例，通過監(jiān)測變化即可判定梨汁中是否添加外源有機(jī)酸。同時(shí)可根據(jù)檢測得到的D-蘋果酸的含量，判斷果汁中是否添加了DL-蘋果酸。該方法快速，簡便，準(zhǔn)確，可靠，為生產(chǎn)企業(yè)及監(jiān)管部門開展梨汁的摻偽鑒別提供了依據(jù)，但不適用
于按比例同時(shí)添加檸檬酸和L-蘋果酸等多種外源有機(jī)酸摻偽梨汁的檢測。
4摘要
檸檬酸和L-蘋果酸是梨汁中2種主要有機(jī)酸。研究了利用高效液相色譜法分離測定梨汁中檸檬酸、L-蘋果酸和D-蘋果酸的條件，同時(shí)對(duì)來源于不同產(chǎn)地和品種梨汁中的檸檬酸和L-蘋果酸的含量進(jìn)行了測定。研究結(jié)果表明，不同品種梨汁中檸檬酸與L-蘋果酸的含量和比例差別較大，同品種梨汁中這兩種有機(jī)酸的比例差別不大。但是，在所有梨汁中檸檬酸的含量均小于蘋果酸的含量，即，檸檬酸和L-蘋果酸含量之比小于100%。因此，當(dāng)梨汁中這兩種有機(jī)酸的比例出現(xiàn)劇烈變化時(shí)，即可判定添加了外源有機(jī)酸。該方法解決了外源有機(jī)酸難以鑒別檢測的難題，為生產(chǎn)企業(yè)及監(jiān)管部門開展梨汁的摻偽鑒別提供了依據(jù)。
