一種提高大鯢皮膠原蛋白肽提取率新方法
作者：李斌
生產(chǎn)中制備膠原蛋白肽的方法有很多，目前使用最多、效果最好的是酶解法。但是由于大鯢皮表面粗糙，皮質較厚而且韌性較強，使其在加工過程中組織不易搗碎、酶解效率低等。采用高溫高壓處理大鯢皮不僅可以去掉部分死皮、色素等雜質，更重要的是可以軟化組織，使魚皮膨脹，提高后續(xù)制備膠原蛋白肽的效率。
1 試驗材料與方法
1.1材料
新鮮大鯢：飼齡3年，四川溪源水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，人工去除肉和骨，用流動自來水徹底洗凈，魚皮切成5 cm3的塊狀，于-18 0C條件下貯藏；羥脯氨酸標準品：100 mg，sigma公司；氫氧化鈉(AR)：成都科龍試劑廠；醋酸鈉( AR)：成都科龍試劑廠；檸檬酸( AR)：成都科龍試劑廠；冰醋酸(AR)：成都科龍試劑廠；正丙醇( AR)：成都科龍試劑廠；氯胺T( AR)：成都科龍試劑廠；對二甲氨基苯甲醛( AR)：成都科龍試劑廠；70u/o過氯酸(AR)：成都科龍試劑廠。
1.2試驗儀器與設備
紫外可見分光光度計：752N，上海精科實業(yè)有限公司；高溫高壓滅菌鍋：上海洪紀儀器設備有限公司；馬弗爐：SX2-12-10N，蘇州江東精密儀器有限公司；微量凱氏定氮儀：KDN-04C，上海洪紀儀器設備有限公司；索氏抽提器：SXT-06，上海洪紀儀器
設備有限公司。
2試驗方法
2.1大鯢皮常規(guī)分析
水分的測定：105℃烘干恒重法“GB/T 5009.3-2010”；粗脂肪的測定：索氏抽提法“GB/T 5009.6-2003”；灰分的測定：箱式電阻爐550 0C灼燒法“GB/T 5009.4-2010”；粗蛋白的測定：微量凱氏定氮法“GB/T 5009.5-2010”。
2.2大鯢皮中膠原蛋白含量的測定問
羥脯氨酸是膠原蛋白肽的特征性氨基酸，不存在于一般的蛋白質及多肽中，故大鯢皮及其酶解液中膠原蛋白肽的含量可由其中所含羥脯氨酸的量乘以換算系數(shù)11.1得到。
2.2.1標準曲線的制作
羥脯氨酸標準曲線的繪制：取羥脯氨酸標準液10 mL，用蒸餾水稀釋至100 mL，制得100 /mL的羥脯氨酸應用液。分別取O，2，4，6，8和10 mL定容至100 mL，制得標準液其質量濃度分別為0，2，4，6，8和10ug/ml。取標準液2 mL，依次加入8 mL正丙醇和2mL氯胺T試劑，室溫下( 25℃)放置25 min。最后加入2mL恩里克試劑，混勻后置于65℃水浴鍋（水浴顯色)20min：冷卻后讀取560 nm下的吸光度。
2.2.2大鯢皮中膠原蛋白含量的測定
按照GB 9695.23-2008“肉和肉制品中L（一）一羥脯氨酸含量測定” 測定方法進行測定大鯢皮中羥請氨酸的含量．乘以系數(shù)11.1即得大鯢皮中所含膠原蛋白的量。
2.3大鯢皮中膠原蛋白肽提取率的計算
X=m/Mx 100% (1)
式中：X-膠原蛋白肽的提取率；m-膠原蛋白肽質量，g；M-大鯢皮膠原蛋白的質量，g。
2.4大鯢皮膠原蛋白肽制備工藝
大鯢皮制備預處理（去雜蛋白、去脂肪）高溫高壓處理酶解與滅活微濾超濾噴霧干燥成品
2.4.1 大鯢皮預處理
將人工養(yǎng)殖大鯢皮4℃冰箱過夜半解凍后，手動去除大鯢皮上殘余的肌肉，剪成0.5 cm×0.5 cm的小片。于4℃下，先用0.1 mol/L NaOH溶液浸泡（液料比值為30 mUg）24 h，以去除非膠原蛋白，其間更換一次堿液；用去離子水洗滌至中性后，再用體積分數(shù)10 010正丁醇溶液浸泡（液料比值為30 mL/g）24 h以去除脂肪，其間更換一次溶液，最后用去離子水洗滌至中性。
2.4.2大鯢皮高溫高壓處理工藝的優(yōu)化
對經(jīng)過預處理的大鯢皮進行高溫高壓處理，以膠原蛋白肽提取率為指標，分別進行料液比、處理壓力、處理時間的單因素試驗，并根據(jù)單因素試驗結果進行中心組合試驗，采用SAS軟件進行響應面分析，確定最佳的高溫高壓處理的工藝條件。
2.4.3酶解與滅酶
將經(jīng)過高溫高壓處理的大鯢皮采用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和馮味蛋白酶三者組成的復合酶進行酶解處理，條件為：酶解溫度為55℃，酶解時間7h，添加量中性蛋白酶3 000 U/g，木瓜蛋白酶8 000 U，風味蛋白酶600 U/g。酶解結束后滅酶，條件為：溫度100℃，時間15 min。
2.4.4微濾
酶解液經(jīng)過
微孔濾膜過濾，得到含大分子的膠原蛋白肽濾液。
2.4.5超濾
將膠原蛋白肽液通過截流量分子量為5 000 Da的超濾膜，壓力為0.4 MPa，最后得到大鯢皮膠原蛋白肽溶液。
2.4.6噴霧干燥
將大鯢皮膠原蛋白肽溶液進行減壓濃縮后噴霧干燥(進風溫度180℃，出風溫度140℃，進料量600mL/h，得到大鯢皮膠原蛋白肽粉。
3結果與討論
3.1大鯢皮的基成分
取等質量頭部、身體及尾部等不同部位的大鯢皮混合，進行分析檢測。分別測定了水分、灰分粗、脂肪和粗蛋白，結果如表1。
3.2大鯢皮的羥脯氨酸含量羥脯氨酸的標準曲線如圖1。
以羥脯氨酸質量濃度(ug/ml)為橫坐標，吸光度（A560）為縱坐標繪制標準曲線，求出線性回歸方程為：
A=0.069 1X+O.O01 52
(2)式中：A-吸光度；X-羥脯氨酸質量濃度，ug.ml。 R2=0.996 81，這說明建立的回歸方程是有意義的。檢測表明人工飼養(yǎng)大鯢皮（濕重）的羥脯氨酸含量質量分數(shù)為2.01%，而魚類膠原蛋白的平均換算系數(shù)為11.1，即膠原蛋白含量為22.31%，占總蛋白質的79.65%，故膠原蛋白是人工飼養(yǎng)大鯢皮中的主要蛋白質。
3.3高溫高壓處理工藝的優(yōu)化確定
3.3.1單因素試驗
3.3.1.1料液比對膠原蛋白肽提取率工藝的影響
將經(jīng)過預處理的大鯢皮，在料液比為1：1．1：1.5,1：2,1：2.5和1：3( g/mL)，壓力為0.1 MPa，處理時間為20 min的條件下進行單因素試驗，結果如圖2。
從圖2中可看出，料液比為1：1( g／mL)時膠原蛋白提取率較低，這是可能是因為較低的料液比條件下底物濃度較大，影響了酶與底物的接觸面積。料液比為1：2( g/mL)時膠原蛋白肽提取率最高為83.6%，料液比為1：2.5和1：3(g/mL)時膠原蛋白肽提取率無明顯差異(P>0.05)。所以后續(xù)的正交試驗在料液比為1：1.5，1：2和1：2.5( g/mL)的區(qū)間內(nèi)進行優(yōu)化。
3.3.1.2壓力對膠原蛋白肽提取率的影響
將經(jīng)過預處理的大鯢皮反復清洗至廢水為中性，在壓力為0.025, 0.05，0.075，0.1和0.125 MPa，料液比為1：2( g/mL)，處理時間為20 min的條件下進行單因素試驗，結果如圖3。
從圖3中可看出，壓力較低時，膠原蛋白肽提取率偏低，隨壓力的升高逐步增大，膠原蛋白肽提取率逐漸增大，最高達到84.8%．壓力為0.1與0.125 MPa時皎原蛋白肽提取率無明顯差異(p>0.05)。所以后續(xù)的中心組合試驗在壓力為0.05，0.075和0.1 MPa的區(qū)間內(nèi)進行優(yōu)化。
3.3.1.3處理時間對熬膠工藝的影響
將經(jīng)過預處理的大鯢皮反復清洗至廢水為中性，在處理時間壓力為10，15，20，25和30 min，料液比為1：2( g/mL)，壓力為0.1 MPa的條件下進行單因素試驗，結果如圖4。
從圖4中可看出，處理時間較短時，膠原蛋白肽提取率偏低，隨處理時間的增加膠原蛋白肽提取率逐步增大，最高達到86.8%，時間為20與25 min時膠原蛋白肽提取率無明顯差異(p>0.05)。所以后續(xù)的中心組合試驗在處理時間為20，25和30 min的區(qū)間內(nèi)進行優(yōu)化。
3.3.2高溫高壓處理大鯢皮工藝條件的優(yōu)化
對經(jīng)過預處理的大鯢皮進行高溫高壓處理，以膠原蛋白肽提取率為指標，料液比(1：1.5，1：2和1：2.5(g/mL))、壓力（0.05, 0.075和0.1 MPa）、處理時間（20，25和30 min）為試驗因素進行三因素的中心組合試驗設計，再采用SAS軟件進行響應面分析，確定最佳的熬膠工藝，因素水平表如表2，結果如表3。
3.3.2.1 回歸模型方差分析及回歸系數(shù)的顯著性檢驗
將所有因子和試驗所得結果采用SAS軟件進行回歸擬合，所得的回歸方程為：
Y=80.466 67-0.137 5X1+1.875X2+0.837 5X3-1.758 333X12+0.525X1X 2-0.15X1X 3-0.233 33X22-0.525X2X3-10 808 333X32
回歸方程中各變量對響應值影響的顯著性用F檢驗判定，p值越小，則響應變量的顯著性程度越高，P< 0.01時，影響極顯著；p<0.05時，影響顯著，對上述回歸模型進行方差分析和回歸系數(shù)的顯著性檢驗，結果如表4。
由表4分析可得：回歸模型的p=0.010 177< 0.05，表明模型顯著，R2=0.946 5，擬合度>90%，表明回歸模型能描述響應值的變化，因此可利用此模型對大鯢皮中膠原蛋白肽提取率的提取率進行分析和預測。回歸模型的一次項X2壓力）的p=0.001 095<0.01，表明壓力對膠原蛋白肽提取率的影響極顯著；X3料液比）的p=0.025 346<0.05，表明料液比對膠原蛋白肽提取率的影響顯著；X1（時間）的p=0.654 922>0.05．表明時間對膠原蛋白肽提取率的影響不顯著，三個因素對膠原蛋白肽提取率影響的大小順序為X2>X3X1交互項對膠原蛋白提取率無顯著影響；二次項X12、X32的P值均小于0.01，說明二者對膠原蛋白肽提取率影響顯著。
3.3.2.2響應面優(yōu)化和預測
利用SAS軟件，通過多元回歸方程作出對大鯢皮膠原蛋白肽提取率影響最顯著的2個因素，即壓力和處理時間的響應面和等值線圖，結果圖5。響應面的頂端為最優(yōu)值。由回歸方程解得試驗最優(yōu)工藝為：料液比1：2( g/mL)、時間25 min、壓力0.075 MPa，每個試驗平行2次。大鯢皮膠原蛋白肽提取率理論值預期可達80.76%。
3.3.2.3驗證試驗
在Box-RSM求得的最佳條件下，對大鯢皮膠原蛋白肽提取率進行5次平行提取試驗，結果見表由表5。可知，實際測得率與理論得率相對誤差為1.12%，RSD=0.3%，說明此工藝是科學的、合理的。
4結論
大鯢皮中羥脯氨酸的含量為2.01%（占濕重），而魚類膠原蛋白的平均換算系數(shù)為11.1，即膠原蛋白含量為22.31%，占總蛋白質的79.65%，故膠原蛋白是大鯢皮中主要的蛋白質，具有很好的開發(fā)價值。
采用高溫高壓處理經(jīng)過預處理的大鯢皮，可以很好地軟化的組織，提高膠原蛋白肽的提取率。通過對影響影響膠原蛋白肽的提取率的三個因素，即料液比、時間和壓力進行單因素試驗和中心組合試驗以及響應面分析得出最佳高溫高壓處理工藝條件為：料液比為1：2( g/mL)、壓力為0.075 MPa、處理時間為25min。
5摘要
以膠原蛋白肽提取率為考察指標，對影響高溫高壓提高大鯢皮膠原蛋白肽提取率的三個主要因素，即料液比、處理時間和處理壓力進行單因素試驗，進而采用中心組合試驗設計進行試驗，用SAS軟件進行響應面分析確定出最佳工藝條件，即料液比為1：2 (g/mL)、處理時間為25 min、處理壓力為0.075 MPa，此時膠原蛋白肽的提取率高達80.76%。
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