一種電化學發(fā)光法測定甲基對硫磷的新方法
作者：鄭曉蒙
建立快速、靈敏、可靠的OPs農(nóng)藥檢測方法對環(huán)境保護和食品安全均具有重要的意義。乙酰膽堿酯酶( AChE)能夠選擇性地催化底物乙酰硫代膽堿(ATCI)發(fā)生水解，生成硫代膽堿(TCI)和乙酸。
乙酰膽堿酯酶的催化活性能被OPs農(nóng)藥所抑制，導致水解產(chǎn)生的硫代膽堿的量減少。利用這一特性可制成用于篩查和測定有機磷農(nóng)藥的生物傳感器�；陔娀瘜W發(fā)光(electrogenerated chemiluminescence，F(xiàn)CL)原理的傳感器不但有電化學傳感器易于實現(xiàn)設備小型化、連續(xù)自動分析的優(yōu)點，而且也具有化學發(fā)光傳感器選擇性好、靈敏度高的優(yōu)點。三聯(lián)吡啶釕( Ru( bpy)32+)由于具有良好的受激發(fā)特性，在電化學發(fā)光領域的應用日益受到人們重視。到目前為止，尚未見到以硫代膽堿作為共反應物的電化學發(fā)光法測定有機磷農(nóng)藥的文獻報道，本文以硫代膽堿作為共反應物，以甲基對硫磷為有機磷農(nóng)藥的模型化合物，建立了電化學發(fā)光檢測有機磷農(nóng)藥的新方法。
1實驗部分
1.1儀器與試劑
電化學分析儀（CHI660A型，上海辰華儀器有限公司）；電化學方法采用三電極系統(tǒng)：以金盤電極(d=2mm)作為工作電極、飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極、鉑絲電極作為對電極；ECL信號由位于電解池前端正對工作電極的光電倍增管（H9306-03型，日本濱松）在避光的暗盒中采集，將ECL信號轉(zhuǎn)換為電信號，利用電化學分析儀對產(chǎn)生的電信號進行輔助記錄，以電壓方式輸出。光電倍增管采用穩(wěn)壓電源(±12 V，朝陽電源)供電，電極的負壓為-900 V，實驗室自行組裝的電化學發(fā)光實驗裝置如圖l所示；KQ218超聲波清洗器（昆明市超聲儀器有限公司）；5418型高速離心機（艾本德中國有限公司）；FA1004電子分析天平（上海天平儀器廠）。
乙酰膽堿酯酶( AChE，Type C3389，425 .94units/mg)、氯化乙酰硫代膽堿(ATCI，A5626，99%)、殼聚糖( CHIT)均購自Sigma公司，戊二醛溶液(50%)購于北京化學試劑公司，氯化三聯(lián)吡啶釕( Ru(bpy)3CL2)購于百靈威科技有限公司，甲基對硫磷購于農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所。實驗用水為超純水( Milli-Q AdvantageA10超純水系統(tǒng)，法國Millipore公司)，其它試劑均為
分析純。
1.2金電極的預處理
在絨布上將金電極用0.05 μmol Al203拋光至形成鏡面，然后將金電極浸泡于新鮮配制的Piranha溶液（濃硫酸：雙氧水=7:3）之中，10 min后取出，接著依次在無水乙醇、超純水中超聲5 min，然后用超純水清洗，N2氣吹干備用。
1.3 乙酰膽堿酯酶的固定
由于溶解于水溶液中的AChE會對電化學發(fā)光信號的測量造成干擾，故本文將AChE固定于一支僅用作酶載體的金盤電極表面進行酶催化反應實驗，采用殼聚糖和戊二醛將AChE固定在金盤電極表面，此方法操作簡單，所用材料生物相容性好，AChE可通過金一硫鍵牢固地結合到金盤電極表面。采用文獻報道方法，首先用2.0 mol/L的乙酸溶液溶解殼聚糖，配制濃度為0.5%（W/V）的殼聚糖( CHIT)溶液，然后用NaOH溶液凋至pH=5.0，放于冰箱中備用。以一支金盤電極（直徑2 mm）作為固定化酶的載體，在拋光處理好的金電極表面滴
加3μL0．5%(W/V)的殼聚糖溶液，室溫下晾干，然后用超純水清洗，N2吹干。繼續(xù)在電極表面依次滴加lμL的戊二醛(2.5%)和5 μL的AChE(0.05 U/μL)，室溫下晾干，之后用超純水清洗，N2吹干，通過此方法，AChE被固定于金盤載體表面，以此方法固定化的AChE記作AChE/CHIT/Au.
1.4 乙酰硫代膽堿的測定
將AChE/CHIT/Au浸泡于不同濃度的ATC1溶液之中1 h，之后取出AChE/CHIT/Au，對溶液進行離心處理(10 min，14 000 r/min)，取25 μL上清液滴加于一支預處理過的裸金電極表面，使酶催化反應產(chǎn)物硫代膽堿在裸金電極表面通過自組裝反應而被富集，室溫下晾干，然后用超純水清洗，N2氣吹干，制得富集了硫代膽堿的金電極TCl/Au，以該電極作工作電極，
將其與參比電極、對電極一同浸入含有2 mmol/L三聯(lián)吡啶釕的10 mL 0.01 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液( PBS)中，以10 mV/s的掃速在0.8—2.0 V的電位范圍記錄電化學發(fā)光信號。
實驗過程如圖2所示。
1.5 甲基對硫磷的檢測
選取合適的ATCI濃度，將AChE/CHIT/Au浸入到含有不同濃度甲基對硫磷的0.01 mol/L pH 7.0的PBS中，溫育6 min，把溫育后的AChE/CHIT/Au取出，浸泡于一定濃度的ATCI溶液之中，溫育1h，然后取出AChE/CHIT/Au，對溶液進行離心處理，取25 μL上清液滴加于裸金電極金電極表面，室溫下晾干，然后用超純水清洗，N2氣吹干，在2 mmol/L的三聯(lián)吡啶釕中記錄電化學發(fā)光強度。將未受到農(nóng)藥抑制的富集了硫代膽堿的金電極所測得的電化學發(fā)光強度記作I1將用富集了受農(nóng)藥抑制的溶液中硫代膽堿的金電極電化學發(fā)光強度記作I2。計算與不同濃度農(nóng)藥相對應的電化學發(fā)光強度值，并根據(jù)下式計算甲基對硫磷對固定化AChE的抑制率（Inh%）：
實驗過程如圖2所示。
1.6 實驗樣品的處理
蔬菜樣品（生菜、青菜）采購于農(nóng)光里市場。首先將樣品清洗干凈，白然晾干，然后每份樣品稱取1.00g，將其切成面積約為1Cm2的小碎片，再均勻噴灑上10.00 g/L甲基對硫磷農(nóng)藥100 μL，隔夜靜置，之后用30 mL乙醚萃取，取上清液過0.45 μm濾膜抽濾，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，向蒸發(fā)用的小燒瓶中加入2 mL乙醇，將殘渣溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，最后用0.1 mol/L KC1定容.
2結果與討論
2.1 實驗條件的優(yōu)化
先用AChE催化不同濃度的ATC1發(fā)生水解，孵育1h之后，生成的硫代膽堿可通過金一硫鍵的結合作用自組裝固定到金電極表面。硫代膽堿能夠起到共反應物的作用，在三聯(lián)吡啶釕的存在下，對修飾后的金電極施加一定的氧化電位，能夠使三聯(lián)吡啶釕產(chǎn)生電化學發(fā)光。其原理如下：
當施加氧化電位時，Ru(bpy)32+被氧化成為Ru( bpy)33+，同時硫代膽堿被氧化為( CH3) 3N+CH2C．HS02-，其與Ru( bpy)33+發(fā)生氧化還原反應，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)的[Ru( bpy)32+]*，[Ru( bpy )32+]*返回基態(tài)時釋放出光子，產(chǎn)生電化學發(fā)光信號�；诖嗽�，使用甲基對硫磷對AChE進行抑制，AChE受到抑制的程度越大，生成的酶催化反應產(chǎn)物硫代膽堿就越少，導致自組裝富集到金電極表面的硫代膽堿的量減少，在本文中硫代膽堿也是電化學發(fā)光的共反應物，因而，電化學發(fā)光信號會隨著AChE受抑制程度的增大而減弱，由此實現(xiàn)對甲基對硫磷的檢測，其過程如圖3所示。
2 .1.1三聯(lián)吡啶釕濃度的選擇
當酶催化溫育時間為1h，ATC1濃度為250mmol/L時，發(fā)光強度與三聯(lián)吡啶釕濃度的關系。如圖4(a)所示，發(fā)光強度隨著三聯(lián)吡啶釕濃度的增大而增大，然而，當三聯(lián)吡啶釕濃度高于2 mmol/L時，發(fā)光強度開始減小，這與鹵素離子濃度的增大有關，本文所用三聯(lián)吡啶釕是其氯化物，其中含有氯離子，研究表明，在電化學發(fā)光實驗中，加入少量的鹵素離子可以阻礙金或鉑電極上氧化層的形成，從而增大電化學發(fā)光強度，提高靈敏度，但是，當鹵素
離子濃度過高時，由于淬滅作用反而會降低電化學發(fā)光強度。因此，本實驗選定三聯(lián)吡啶釕的濃度為2 mmol/L。，
2.1.2酶催化溫育時間的選擇
首先通過AChE催化水解ATCI,然后將生成的TCI自組裝到金電極表面，進而檢測發(fā)光信號，因此，AChE催化ATCI水解反應的時間對發(fā)光信號也會有一定影響。圖4(b)為當三聯(lián)吡啶釕濃度為2 mmol/L、ATCI濃度為120 mmol/L時的酶催化反應溫育時間與發(fā)光強度的關系。隨著時間的增加，發(fā)光強度開始增大，當溫育時間達到60 min時，發(fā)光強度趨于穩(wěn)定。因此，本文采用的溫育時間為1h。
2 .1.3乙酰硫代膽堿濃度對電化學發(fā)光強度的影響
圖5為修飾電極在不同濃度ATCI溫育1h之后，在三聯(lián)吡啶釕溶液中的電化學發(fā)光圖。隨著ATCI濃度的增大，電化學發(fā)光信號越來越大，在5～500 mmol/L范圍內(nèi)，電化學發(fā)光信號與ATCI的濃度呈線性關系，線性回歸方程為/=0.095 85+0.007 32c，其中I為電化學發(fā)光信號強度(V)，C為ATCI的濃度(mmol/L)，相關系數(shù)為R=0.999 0。本文在后續(xù)實驗中采用乙酰硫代膽堿的濃度為250 mmol/L的，因為這個濃度條件下既能夠保證在線性范圍條件內(nèi)實現(xiàn)農(nóng)藥對酶活性的有效抑制，又能夠節(jié)省試劑。
2.2 甲基對硫磷的檢測
修飾電極受到農(nóng)藥抑制時間的長短，會影響到固定在電極上的AChE對底物ATCI的催化作用，進而會影響到TCI的發(fā)光強度。如圖6所示，當三聯(lián)吡啶釕濃度為2 mmol/L、酶催化溫育時間為1h、ATCI濃度為250 mmol/L時，將制備的一系列修飾電極浸入含有3.8xl0-5 mol/L甲基對硫磷的0.01 mol/L PBS中溫育：由圖6可見，隨溫育時間的增加，發(fā)光強度明顯減小，當達到6 min時，發(fā)光強度趨于穩(wěn)定，甲基對硫磷與AChE活性位點的結合趨于飽和，再延長溫育時間對AChE的活性影響不大。因此，本文采用的溫育時間為6 min.
如圖7昕示，將修飾電極在不同濃度的甲基對硫磷緩沖溶液中溫育6 min，之后在濃度為250 mmol/L的ATCI溶液巾溫育1h．然后記錄在三聯(lián)吡啶釕中的電化學發(fā)光圖。隨著農(nóng)藥濃度的增大，電化學發(fā)光信號越來越小，以百分抑制率對農(nóng)藥濃度的對數(shù)作圖，在4.6xl0-6—4.OxlO-3 mol/L甲基對硫磷濃度范圍內(nèi)，酶抑制率與甲基對硫磷濃度的對數(shù)成比例，線性回歸方程為Inh%=159.35+27.390 lgc，相關系數(shù)為R=0.998 4，按抑制率為5%時所對應的農(nóng)藥濃度計算得檢測限為2.3xl0-6 mol/L。
2.3方法的重現(xiàn)性和選擇性
為考察電極重現(xiàn)性，采用8支不同的AChE/CHIT/Au電極，在含有6.6xl0-4m01／L甲基對硫磷的0.01mol/L pH 7.0的PBS中溫育6min，然后在濃度為250 mmol/L的ATC1溶液中溫育1h，在三聯(lián)吡啶釕溶液中分別檢測8支AChE/CHIT/Au電極的電化學發(fā)光信號，其相對標準偏差RSD=3.5%，表明本文制備AChE/CHIT/Au電極的方法具有較好的重現(xiàn)性。
在優(yōu)化的實驗條件下，考察了常見離子對測定甲基對硫磷的干擾情況。在含有8.50xl0-5mol／L甲基對硫磷的0.01 mol/L pH 7.0的PBS中，分別加入P043-、S 042-、N03-、Ca2+、Mg2+和Fe3+溶液，使它們在溶液中的濃度均為0.100 mol/L，實驗結果表明，以上物質(zhì)對甲
基對硫磷的測定均無明顯干擾，如圖8所示。
2.4應用
采用標準加入法將制備的傳感器分別用于生菜和青菜樣品中甲基對硫磷的檢測，取得了較好的回收率，表明此方法能夠用于農(nóng)藥檢測分析，實驗結果如表1所示。
3結論
本文首先將AChE固定在金盤表面，然后通過固定化的AChE對ATC1的催化反應，產(chǎn)生硫代膽堿．將生成的硫代膽堿自組裝固定在另一支裸金電極表面，基于有機磷農(nóng)藥對AChE的抑制作用，利用電化學發(fā)光法，對不同濃度的甲基對硫磷進行了檢測，在4.6xl0-6～4.Oxl0-3 mol/L甲基對硫磷濃度范圍內(nèi)，酶抑制率與甲基對硫磷濃度的對數(shù)成正比關系，檢測限為2.3xl0-6mol/L。本文提出的方法具有實驗操作簡便、靈敏度高等優(yōu)點。該方法在基于酶抑制原理快速檢測環(huán)境中的有機磷農(nóng)藥等領域有著很好的應用前景。
4摘要：
首先利用殼聚糖( CHIT)和戊二醛將乙酰膽堿酯酶(AChE)固定到金盤載體表面，然后利用固定的乙酰膽堿酯酶催化乙酰硫代膽堿( ATCI)水解，使生成的硫代膽堿(TCI)組裝到一支裸金電極表面，以三聯(lián)吡啶釘(Ru( bpy )32+）作為發(fā)光試劑，以自組裝在金電極表面的硫代膽堿作共反應物，在1 500 mV獲得r靈敏的電化學發(fā)光信號，基于甲基對硫磷對固定化的AChE抑制的原理建立了電化學發(fā)光法測定甲基對硫磷的方法。在優(yōu)化的實驗條件下，酶的抑制率與甲基對硫磷濃度的對數(shù)在4.6xl0-6~4.Oxl0-3 mol/L濃度范圍成正比關系，檢測限為2.3xl06mol/L。
