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     作者：鄭曉蒙

    響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)磷脂酶C菌株的培養(yǎng)條件內(nèi)容簡(jiǎn)介：

    自然界中，已發(fā)現(xiàn)十多種菌可以產(chǎn)生磷脂酶C( PLC)，這些菌中有呈革蘭氏陽(yáng)性菌，也有呈革蘭氏陰性菌。陳濤等經(jīng)過(guò)初篩、復(fù)篩篩選出一株高產(chǎn)PLC的蠟樣芽孢桿菌深圳株754-1。該菌屬于異養(yǎng)型細(xì)菌，均有易培養(yǎng)，芽孢抗逆性強(qiáng)，保藏性能好，發(fā)酵后易于除去菌體等特點(diǎn)，是用來(lái)培養(yǎng)生產(chǎn)磷脂酶C的較好菌種。微生物發(fā)酵可以制取磷脂酶C，從而可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化磷脂酶C的大量生產(chǎn)。

    微生物的發(fā)酵生產(chǎn)水平不僅與生產(chǎn)菌種本身的特性有關(guān)，還與培養(yǎng)條件有著不可分割的關(guān)系，在與之相匹配的培養(yǎng)條件下，微生物才能更好的生長(zhǎng)、繁殖并積累更多的代謝產(chǎn)物。對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的蠟樣芽孢桿菌深圳株754-1通過(guò)種子培養(yǎng)，搖瓶發(fā)酵，考察接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基初始pH等條件對(duì)其產(chǎn)PLC活性的影響。然后采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化各因素最佳反應(yīng)值，使每毫升發(fā)酵液中PLC活性達(dá)到最高，為工業(yè)化推廣提供數(shù)據(jù)。

    1  材料與方法

    1.1材料與試劑

    1.1.1菌種

    蠟樣芽孢桿菌深圳株754-1，實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.1.2試劑

    葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、尿素、山梨醇、對(duì)硝基苯磷酸膽堿( NPPC)、Tris試劑、鹽酸、ZnCl2。

    1.2儀器與設(shè)備

    HYQ-150S全溫?fù)u床：武漢匯誠(chéng)生物科技有限公司；SPX-150C恒溫恒濕箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-IF單人雙面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；LDZX-75KB立式蒸汽滅菌器：武漢利天科技儀器有限公司；PHS-25數(shù)顯pH計(jì)：上海雷磁儀器廠；TDL-5-A臺(tái)式低速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；XSP-BM-2CA生物顯微鏡：上海上光新光學(xué)科學(xué)有限公司。

    1.3試驗(yàn)方法

    1.3.1  菌種的活化

    將菌種轉(zhuǎn)接至富集培基上，于32℃恒溫靜止培養(yǎng)2～3 d。菌種經(jīng)富集后，在分離平板上劃線分離，26℃恒溫培養(yǎng)，經(jīng)多次分離獲得單菌落菌株。挑選純的單菌落作為活化種子轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)。

    1.3.2種子培養(yǎng)

    從平板中純的單菌落處挑取一環(huán)，轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基中，置于搖床上32℃、180 r/min條件下培養(yǎng)10-12h。

    1.3.3發(fā)酵培養(yǎng)

    將種子液按10%的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，32℃、180 r/min條件下震蕩培養(yǎng)20 h。

    1.3.4粗酶液的制備

    將發(fā)酵液收集起來(lái)，然后用低速離心機(jī)離心，轉(zhuǎn)速4 000 r/min，離心10 min，取上清液，其中含有所需的磷脂酶C。

    1.4分析方法

    1.4.1酶活的測(cè)定

    PLC酶活NPPC法測(cè)定：該法時(shí)基于PLC水解NPPC產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚的量來(lái)反映酶活的高低。

    酶反應(yīng)體系：0.25 mol/L Tris-HCl( pH 7.2)，0.001 mol/L ZnCl2，60 g/100 mL山梨醇，10 nmol/LNPPC。

    取2 mL酶反應(yīng)體系溶液，向其中添加100 μL磷脂酶C樣品，37℃保溫反應(yīng)30 min。得到PLC酶解NPPC產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚的量，利用分光光度法測(cè)定酶反應(yīng)液在410 nm處的吸光度A，從而定量PLC的酶活大小。酶活計(jì)算公式：

    酶活力( U/mL) =1.363 6×l03×A/t    (1)

    式中：A-吸光度；t-反應(yīng)時(shí)間。

    酶活單位定義：在特定的條件下，每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1 nmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量為1個(gè)酶活單位(U)。

    1.4.2單因素試驗(yàn)

    微生物在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)條件的不同對(duì)微生物的生長(zhǎng)代謝的影響也不同，因此發(fā)酵條件的選擇直接關(guān)系著磷脂酶C的產(chǎn)量和酶活，試驗(yàn)考察了接種量（1%，3%，5%，7%，9%和11%），培養(yǎng)溫度(20℃，24℃，28℃，32℃，36℃和40℃)，培養(yǎng)時(shí)間（12，16，20，24和28 h），培養(yǎng)基初始pH（5.5，6.0，6.5，7.0，7.5和8.0）對(duì)磷脂酶C的影響，以每毫升發(fā)酵液的酶活為單位，確定最佳工藝條件。

    1.4.3響應(yīng)面優(yōu)化

    在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇與PLC活性關(guān)系密切的重要因素，使用Minitab 16軟件的Box-Behnken進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)3次，并分析試驗(yàn)獲得重要因素的最佳配方水平，并進(jìn)行驗(yàn)證。

    2結(jié)果與分析

    2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

    2.1.1接種量對(duì)產(chǎn)PLC活性的影響

    菌種在32℃，初始pH為7的條件下以不同的接種量（1%，3%，5%，7%，9%和11%）培養(yǎng)20 h。由圖1可知，當(dāng)接種量為5%時(shí)，代謝產(chǎn)物磷脂酶C產(chǎn)量最高。接種量為1%，3%時(shí)，可能是因?yàn)檠舆t期過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致菌種生長(zhǎng)緩慢，其產(chǎn)量相對(duì)較低，而接種量為9%，11%時(shí)，菌種生長(zhǎng)旺盛，營(yíng)養(yǎng)消耗過(guò)快，副產(chǎn)物反饋抑制，導(dǎo)致其PLC產(chǎn)量降低，因此選擇最佳接種量為5%。

    2.1.2培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)PLC活性的影響

    菌種在以5%接種量，初始pH為7，不同溫度(20℃，24℃，28℃，32℃，36℃和40℃)條件下培養(yǎng)20 h。由圖2可知，溫度在24℃—32℃的溫度范圍內(nèi)，磷脂酶C產(chǎn)量隨溫度增加而不斷增加，在32℃達(dá)到最大；當(dāng)溫度繼續(xù)升高，菌種生長(zhǎng)受到抑制，導(dǎo)致產(chǎn)物積累減少，可能是溫度過(guò)高菌種發(fā)酵減緩且PLC酶活降低所致。

    2.1.3培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)PLC活性的影響

    菌種在32℃，接種量為5%，初始pH為7的條件下分別培養(yǎng)12，16，20，24和28 h。從圖3可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，PLC的量先增加后減小，在24 h達(dá)到最大，可能是在培養(yǎng)的對(duì)數(shù)期營(yíng)養(yǎng)豐富，菌體急劇增加，產(chǎn)酶量也相應(yīng)增加，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，環(huán)境發(fā)生變化，產(chǎn)酶受到抑制。因此，培養(yǎng)時(shí)間不宜太長(zhǎng)，確定發(fā)酵時(shí)間為24 h。

    2 .1.4初始pH對(duì)產(chǎn)PLC活性的影響

    菌種在初始pH分別為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5和8.0的情況下，32℃，接種量為5%培養(yǎng)20 h。從圖4可見(jiàn)，初始pH為7.0時(shí)，PLC產(chǎn)量最大，當(dāng)pH為6.5—7.5時(shí)，PLC產(chǎn)量維持在相對(duì)較高的水平，當(dāng)pH過(guò)高或過(guò)低時(shí)都會(huì)給菌體生長(zhǎng)帶來(lái)?yè)p傷。由此，選擇pH為7.0為發(fā)酵培養(yǎng)基的初始值。

    2.2響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

    2.2.1  響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

    結(jié)合上述單因素試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析，選取對(duì)PLC產(chǎn)量影響較大的3個(gè)因素：接種量（X1），溫度（X2），初始pH（X3）。利用Minitab16軟件的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以培養(yǎng)液PLC活性為響應(yīng)值尋找最優(yōu)條件，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表1和表2所示。

    2.2.2  回歸方程方差分析

    應(yīng)用Minitab16軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合分析，建立回歸模型：Y=24.7333-1.5750X1+0.7000X2+0.3500X3-0.7000X1X2+0.5500X1X3-1.7000X2X3-1.6167X12-2.6667X22-3.5667X32，對(duì)二次模型進(jìn)行分析，分析結(jié)果如表3所示。

    由表3結(jié)果可知，回歸方程p=0.003<0.01，方程極其顯著，接種量(X1)影響極其顯著，溫度（X2），初始pH（X3）影響不顯著，各因素的二次項(xiàng)影響極其顯著，交互作用X2X3影響顯著，XlX2和XlX3不顯著。模型的校正決定系數(shù)R-Sq=97.01%，R-Sq（調(diào)整）=91.64%，這2個(gè)值都高于90%且較接近，表示可以使用該模型來(lái)分析響應(yīng)值。

    失擬( Lack-of-Fit)表示模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值不擬合的概率，反應(yīng)擬合出來(lái)的模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)的接近程度。從表3可知：模型失擬檢驗(yàn)的p=0.281> 0.05，因此，回歸模型適合，不需對(duì)回歸議程調(diào)整，試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠，分析結(jié)果可信，可以用此模型對(duì)PLC酶活進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

    各因素間交互作用對(duì)應(yīng)的影響如圖5~圖7所示，由此可知，溫度和初始pH間交互作用對(duì)酶活影響顯著，溫度和接種量，初始pH和接種量間交互作用對(duì)酶活影響不顯著。對(duì)方程得到模型進(jìn)行分析，規(guī)劃求解得X1=-0.541 5，X2=0.216 4，X3=-0.044 3，最大響應(yīng)值為25.23即接種量為3.92%，溫度為32.43℃，初始pH為6.98時(shí)，PLC酶活最大為25.23 U/mL。為I驗(yàn)證預(yù)測(cè)值的真實(shí)性，在此優(yōu)化條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，重復(fù)3次，試驗(yàn)所得PLC酶活平均值為25.41 U/mL，預(yù)測(cè)值與實(shí)際值相近，說(shuō)明模型擬合度較好。

    3結(jié)論

    試驗(yàn)證明利用響應(yīng)面法優(yōu)化蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)PLC的發(fā)酵條件是非常有效的工具，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，BBD設(shè)計(jì)能建立主要因素影響PLC的二次多項(xiàng)回歸模型，并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法找出最佳值。最后得出產(chǎn)PLC最佳發(fā)酵條件：接種量3.92%，培養(yǎng)溫度32.43℃，培養(yǎng)時(shí)間24 h，初始pH 6.98，在優(yōu)化條件下連續(xù)3批次試驗(yàn)驗(yàn)證得到蠟樣芽孢桿菌深圳株754-1 PLC的產(chǎn)酶水平達(dá)到25.23 U/mL，與預(yù)測(cè)值相近，該優(yōu)化結(jié)果在同類研究中處于較高水平，具有工業(yè)化潛力。

    4 評(píng)述：

    為了得到發(fā)酵法制取磷脂酶C (PLC)的最佳培養(yǎng)條件。首先通過(guò)單因素試驗(yàn)考察接種量，培養(yǎng)時(shí)間，培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)基初始pH等對(duì)PLC酶活水平的影響，然后選擇裝液量，培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)基初始pH 3個(gè)主要影響因素，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，得到搖瓶產(chǎn)PLC的最佳產(chǎn)酶條件為：接種量3.92%，溫度32.43℃，發(fā)酵時(shí)間24 h，初始pH 6.98，在此培養(yǎng)條件下，蠟樣芽孢桿菌深圳株754-1PLC的產(chǎn)酶水平最大達(dá)到25.23 U/mL。